顧選 崔秀梅 余春霞 馬長(zhǎng)華 肖瑤 韓麗 劉春生 趙百孝 哈略

·巴西草藥研究專題·

基于DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用的巴西草藥DENTEDE LE?O(蒲公英)的混偽品鑒定及生藥學(xué)研究

顧選 崔秀梅 余春霞 馬長(zhǎng)華 肖瑤 韓麗 劉春生 趙百孝 哈略

目的 對(duì)巴西市場(chǎng)上銷售的藥用蒲公英的混偽品進(jìn)行鑒定及生藥學(xué)研究。方法 通過(guò)提取樣品DNA、PCR擴(kuò)增及雙向測(cè)序,獲得樣品的ITS序列。采用相似度分析法進(jìn)行分子鑒定;根據(jù)植物產(chǎn)地分布特征和形態(tài)特征驗(yàn)證結(jié)果,三種方法聯(lián)用獲得鑒定結(jié)果;分析混偽品的性狀和顯微特征。結(jié)果 DNA條形碼研究表明巴西藥用蒲公英的混偽品來(lái)源于菊科植物假蒲公英貓兒菊Hypochaeris radicata的全草,產(chǎn)地分析和形態(tài)分析驗(yàn)證了DNA條形碼鑒定結(jié)果。結(jié)論 巴西藥用蒲公英的混偽品來(lái)源于菊科蒲公英屬植物假蒲公英貓兒菊Hypochaeris radicata的全草?；靷纹返纳帉W(xué)特征能夠?yàn)榘臀鞑菟嶥ENTE DE LE?O的真?zhèn)舞b別提供依據(jù)。

巴西草藥; 藥用蒲公英; 混偽品; DNA條形碼; 鑒定

草藥DENTE DE LE?O是巴西民族的常用藥,常作為助消化與利水通淋類藥物[1]。筆者在走訪巴西藥材市場(chǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn),DENTE DE LE?O被人們當(dāng)做藥用蒲公英Taraxacum officinale出售及使用,有研究亦認(rèn)為DENTE DE LE?O的來(lái)源為藥用蒲公英。但是筆者發(fā)現(xiàn),市場(chǎng)上收集的草藥DENTE DE LE?O與藥用蒲公英植物的性狀描述有差異。為保證巴西藥用蒲公英臨床使用的準(zhǔn)確性和安全性,有必要對(duì)巴西藥用蒲公英的混偽品進(jìn)行品種鑒定研究,為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

性狀鑒定方法具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn),但其依賴于鑒定者的經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)資料,主觀性較強(qiáng)[2],顯微特征往往難以解決屬以下近緣種藥材的鑒定難題[3]。隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展,DNA條形碼技術(shù)憑借高效、準(zhǔn)確、客觀、能夠鑒別無(wú)背景信息的樣品的優(yōu)點(diǎn)[4-5],廣泛應(yīng)用于中藥鑒定[6-8]。但是,對(duì)于原始部落的民族藥用植物,同屬物種親緣關(guān)系密切,條形碼相似度極高,還存在數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)物種序列不全面的問(wèn)題,DNA條形碼鑒定方法不能完全解決民族藥鑒定的問(wèn)題。藥用植物通常具有其固定的產(chǎn)地,尤其是野生藥用植物,產(chǎn)地信息對(duì)藥材鑒定有重要作用。植物的部分信息,如葉片形態(tài)、花蕾、果實(shí)信息等,在科屬確定的基礎(chǔ)上,對(duì)種的鑒別具有重要意義[9]?；谝陨纤悸?本研究采用“DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)”聯(lián)用方法對(duì)藥材混偽品進(jìn)行鑒定,該方法能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的缺點(diǎn),為藥材鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2012年4月于巴西隆城市場(chǎng)采購(gòu)巴西藥用蒲公英偽品3批,每批200 g,樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室。

1.2 試劑

廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司,批號(hào):69632855)、Taq酶等PCR試劑(上海生工生物工程有限公司,批號(hào): 695673BE)、乙醇、瓊脂糖、ddH2O等。

1.3 儀器

SIGMA3K-15低溫高速離心機(jī)(SIGMA公司), TECHNE TC-3000PCR擴(kuò)增儀,Bio-Rad電泳儀,水平電泳槽(北京六一儀器廠),JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司),GRANT制冰機(jī),超純水制備系統(tǒng),KQ5200E型超聲波清洗器, SANYO-80℃超低溫冰箱(SANYO公司),DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 DNA提取和PCR擴(kuò)增

方法取樣品,觀察形態(tài),形態(tài)結(jié)果一致。取葉片進(jìn)行DNA提取。各份樣本分別用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉,采用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。采用ITS序列通用引物在熱循環(huán)擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件:50μL體系含 2×Taq PCR MasterMix 25μL,引物 P1和 P4各加2.5μL(5 μmol/L),DNA模板4μL,ddH2O 16μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性1分鐘,55℃退火1分鐘,72℃延伸1分鐘,40個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10分鐘[3]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下檢視,均由上海生工生物工程有限公司測(cè)序部測(cè)序。各樣品均采用正向和反向測(cè)序,以保證測(cè)序的準(zhǔn)確性。

1.5 序列分析方法

利用ContigExpress軟件對(duì)測(cè)序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接,根據(jù)ITS序列邊界保守區(qū)截取待鑒定物種的ITS全長(zhǎng)序列,然后利用相似度法分析序列。

1.6 基于DNA條形碼的鑒定方法

根據(jù)NCBI中BLAST功能,檢索NCBI中注冊(cè)的相似度最高的物種,按照相似度最高的物種截取ITS全長(zhǎng)。再利用樣品的ITS序列檢索,本文以相似度90%[11-12]為科屬的鑒定閾值,以最高相似度科屬為鑒定依據(jù);以相似度97%為物種鑒定閾值,認(rèn)為相似度在97%以上可能為相同物種,否則,數(shù)據(jù)庫(kù)中可能未收錄該序列,以相似度97%以上的最高相似度物種為鑒定依據(jù),獲得鑒定結(jié)果。

1.7 基于產(chǎn)地分析的鑒定方法

根據(jù)“1.6”項(xiàng)下獲得的物種鑒定結(jié)果,依據(jù)《巴西植物志》記載該屬植物物種信息,如果最高相似度物種與產(chǎn)地分析不符合,分析第二最高相似度物種,直到符合產(chǎn)地分析要求,獲得物種的鑒定結(jié)果。

1.8 基于形態(tài)分析的鑒定方法

根據(jù)“1.7”項(xiàng)下獲得的鑒定結(jié)果,查詢《巴西植物志》數(shù)據(jù)庫(kù)中巴西草藥的形態(tài)信息,通過(guò)形態(tài)核對(duì),進(jìn)一步證實(shí)“1.7”項(xiàng)下的鑒定結(jié)果。

1.9 生藥學(xué)研究及比較

根據(jù)顏色、形狀、大小等觀察混偽品的性狀特征,在顯微鏡下觀察顯微特征,描述混偽品的性狀和顯微特征,比較混偽品和藥用蒲公英的區(qū)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于DNA條形碼的鑒定

2.1.1 科屬的鑒定3份樣品的測(cè)序峰圖良好,3份樣品的測(cè)序結(jié)果一致,選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后,經(jīng)BLAST檢索,樣品與菊科貓兒菊屬Hypochaeris L.植物相似度最高,相似度范圍為91%～100%,與其他屬相似度均低于91%。因此,該樣品來(lái)自菊科貓兒菊屬植物。

2.1.2 種的鑒定 根據(jù)DNA條形碼鑒定指標(biāo)(相同物種相似度達(dá)到97%以上,相似度最高的物種為最佳鑒定結(jié)果),樣品與假蒲公英貓兒菊Hypochaeris radicata的相似度最高,相似度為100%,因此,巴西藥用蒲公英偽品的基原為假蒲公英貓兒菊。

2.2 基于產(chǎn)地分析的鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)記載,南美洲國(guó)家很早引進(jìn)假蒲公英貓兒菊物種,巴西20世紀(jì)已有假蒲公英貓兒菊物種的記載。因此,從產(chǎn)地信息分析,該巴西草藥可能為Hypochaeris radicata。

2.3 基于形態(tài)分析的鑒定

樣品具有主根。葉倒披針形,基部狹窄,邊緣波狀齒,先端圓形?；ň哂猩贁?shù)幾個(gè)頭狀花序,小花呈明亮的黃色。瘦果棕色,體圓筒狀,具有冠毛。與藥用蒲公英的主要區(qū)別是:藥用蒲公英葉片形狀具有明顯羽狀深裂,頂端裂片三角形[13];而假蒲公英貓兒菊葉片披針形,邊緣波狀齒,先端圓形。根據(jù)以上特征,本品與www.efloras.org數(shù)據(jù)庫(kù)中收載的假蒲公英貓兒菊的形態(tài)特征基本符合,因此,根據(jù)形態(tài)分析,本品來(lái)源于菊科假蒲公英貓兒菊的全草。

2.4 混偽品的生藥學(xué)研究

2.4.1 性狀特征 混偽品根頭部倒圓錐形,基生,花梗一至數(shù)個(gè)。葉多皺縮破碎,灰綠色或綠褐色,富黃白色柔毛,先端鈍或尖,葉基部漸狹,下延成柄狀,淺裂。花倒圓錐形,有時(shí)稍壓扁呈扇形。頭狀花序,總苞片多層,外層為舌狀花,管狀花多數(shù),位于中央,黃色?；ü］^長(zhǎng),灰綠色,中空,光滑,直徑0.2～0.7 cm,折斷面纖維性,外層灰綠色,內(nèi)層黃白色,內(nèi)層質(zhì)松軟,有彈性。果橢圓形,具白色冠狀毛,由花托處發(fā)射狀長(zhǎng)出瘦果?；靷纹放c藥用蒲公英在葉片形狀上存在較大的區(qū)別:藥用蒲公英葉片形狀具有明顯羽狀深裂,頂端裂片三角形;而假蒲公英貓兒菊葉片披針形,邊緣波狀齒,先端圓形。

2.4.2 顯微特征 粉末棕黃色。(1)導(dǎo)管常見(jiàn)具緣紋孔導(dǎo)管,少見(jiàn)螺紋導(dǎo)管或雙螺紋導(dǎo)管。(2)花粉粒類球形,外壁有刺。(3)菊糖結(jié)晶,不規(guī)則形。(4)石細(xì)胞淡黃棕色,類方形,類長(zhǎng)方形,類圓形或不規(guī)則形,有的層紋明顯,壁較厚。

3 討論

傳統(tǒng)的鑒定方法依靠文獻(xiàn)和鑒定人員的經(jīng)驗(yàn),不能鑒別無(wú)背景信息的藥材,DNA條形碼技術(shù)能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的不足,通過(guò)分子鑒定技術(shù)能夠?qū)o(wú)背景信息藥材鑒定,不受樣品開(kāi)花季節(jié)及樣品外形的影響。有時(shí)相似度最高的序列有多個(gè)物種,這時(shí)利用分子鑒定技術(shù)進(jìn)行藥材鑒定也存在困難;采用產(chǎn)地分析和形態(tài)分析能夠較好的驗(yàn)證DNA條形碼鑒定方法的鑒定結(jié)果,得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。采用DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)聯(lián)合分析,能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)未知樣品進(jìn)行鑒定。通過(guò)生藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn),性狀特征能夠?yàn)榘臀鞑菟幍馁|(zhì)量控制提供依據(jù)。

假蒲公英貓兒菊原產(chǎn)于非洲北部和歐洲,而后,非洲南部和亞洲東南部、澳洲印度北部、日本、北美、南美以及太平洋群島引進(jìn)該物種。在1974年中國(guó)發(fā)現(xiàn)該物種,最早見(jiàn)于《臺(tái)灣植物志》。由于花色鮮艷,可用于盆栽或切花[14]。假蒲公英貓兒菊與藥用蒲公英在形態(tài)特征上較為相似,易導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)不足的人誤采誤收,給臨床上的準(zhǔn)確用藥帶來(lái)潛在的威脅。因此,采藥和用藥人員應(yīng)注意觀察藥用蒲公英的葉片特征來(lái)鑒別物種,保證準(zhǔn)確用藥。

[1] 修銳,金華.藥蒲公英的藥理作用[J].國(guó)外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè),2008,23(1):11.

[2] 季峰.淺談中藥的性狀鑒定[J].國(guó)醫(yī)論壇,2006,21(6):48.

[3] 杜曄.詮釋中藥鑒定四大鑒定方法[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué),2012, 2(5):101-102.

[4] 黃璐琦,肖培根,郭蘭萍,等.分子生藥學(xué):一門新興的邊緣學(xué)科[J].中國(guó)科學(xué)C輯:生命科學(xué),2009,(39):1101-1110.

[5] Xin T Y,Yao H,Gao H H,et.Super food Lycium barbarum(Solanaceae)traceability via an internal transcribed spacer2 barcode [J].Food Research International,2013,54(2):1699.

[6] 許亮,劉春生,楊燕云,等.DNA條形碼技術(shù)鑒定一種植物樣品的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(7):217-219.

[7] 葉子,盧葉,王崢濤,等.基于ITS序列鑒別石斛類藥材[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(20):3930-3935.

[8] 陳士林,姚輝,韓建萍.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(2):141.

[9] 顧選,張曉芹,宋曉娜,等.基于DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)聯(lián)用的藥材鑒定新方法研究-以黑果枸杞一種偽品為例[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(24):4759.

[10] 程小麗,廖彩麗,劉春生,等.基于NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)的紫荊皮混淆品種華中五味子的DNA鑒定研究[J].中國(guó)中藥雜志, 2012,37(17):2534.

[11] 屈良鵠,陳月琴.生物分子分類檢索表——原理與方法[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1999,38(1):11.

[12] Landeweert R,Leeflang P,Kuyper T W,et al.Molecular identification of ectomycorrhizalmyeelium in soil horizons[J]. Appl Environ Mierobiol,2003,69(1):327.

[13] 中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京:北京科技衛(wèi)生出版社,1995,2(2):1.

[14] 葉喜陽(yáng),李根有,馬丹丹,等.浙江省逸生分布新紀(jì)錄植物——?dú)W洲貓兒菊[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào),2007,24(5):647.

The pharmacognosy research on the adulterants of Brazilian herb DENTE DE LE?O based on a combined analysis of DNA barcoding-origin-morphology

GU Xuan,CUIXiu-mei,YU Chun-xia,etal. School ofChinese Materia Medica,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:LIU Chun-sheng,E-mail:max_liucs@263.net

Objective To study a new adulterant of DENTE DE LE?O in Brazil and perform a pharmaceutical analysi.M ethods Total genomic DNA was isolated from thematerials,,and nuclear DNA ITS sequences were amplified and sequenced.Similarity identification of BLAST analysis was performed. Next,the results were verified according to plant geographical distribution and morphological profiles. Finally,the features of adulterant were demonstrated through microscopic observation.Results

Adulterants of Brazil herbs DENTE DE LE?O was Hypochaeris radicata Linnaeus,Sp.Pl.The origin analysis and morphological analysis verified the results of DNA barcoding.Conclusion Adulterants of Brazilian herb DENTE DE LE?O are from the Asteraceae plant Hypochaeris radicata with the whole plants. Adulterants pharmacognosy features can provide the basis for identification of Brazil herbs DENTE DE LE?O.

Brazilian herb; DENTE DE LE?O; Adulterants; DNA barcoding; Identification

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.004

2015-08-22)

(本文編輯:董歷華)

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)(2011DFA31370)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(劉春生、馬長(zhǎng)華),針灸推拿學(xué)院[趙百孝、哈略(碩士研究生)],中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)研究所(韓麗);北京華邈中藥工程技術(shù)開(kāi)發(fā)中心(顧選、崔秀梅);河南省藥品審評(píng)認(rèn)證中心(余春霞)

顧選(1990-),女,碩士。研究方向:藥用植物與分子生藥學(xué)。E-mail:guxuan123.love@163.com

劉春生(1964-),博士,教授,博士生導(dǎo)師。研究方向:藥用植物與分子生藥學(xué)。E-mail:max_liucs@263.net