曹吳冰 高連印 車(chē)念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文 王融冰 羅佳佳

·論著·

清毒湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性重癥肝損傷大鼠內(nèi)毒素及D-乳酸表達(dá)的影響

曹吳冰 高連印 車(chē)念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文 王融冰 羅佳佳

目的 觀察清毒湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性重癥肝損傷大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、內(nèi)毒素、凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin activity,PTA)及D-乳酸表達(dá)的影響,探討該方治療慢性重型肝炎內(nèi)毒素血癥的作用機(jī)制。方法 建立TAA致實(shí)驗(yàn)性大鼠重癥肝損傷模型,清毒湯干預(yù)后,檢測(cè)大鼠ALT、內(nèi)毒素、PTA及D-乳酸的表達(dá)水平。結(jié)果 與正常組比較,模型組大鼠ALT、內(nèi)毒素、D-乳酸水平均顯著升高(P＜0.01),PTA水平顯著下降(P＜0.01);與模型組比較,清毒湯低、中劑量組及乳果糖組血清ALT、內(nèi)毒素、PTA及D-乳酸表達(dá)水平均有不同程度的改善(P＜0.05),清毒湯高劑量組除血清內(nèi)毒素含量外各指標(biāo)均明顯改善(P＜0.05);與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組除PTA外各指標(biāo)均不同程度降低(P＜0.05),低劑量組各指標(biāo)均無(wú)明顯差異(P＞0.05),高劑量組除PTA外各指標(biāo)明顯高于乳果糖組(P＜0.05)。結(jié)論 清毒湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠有較好的改善肝損傷和降低內(nèi)毒素表達(dá)的作用,尤其中劑量組最為明顯,推測(cè)其作用機(jī)制可能與降低腸道通透性相關(guān)。

肝損傷; 內(nèi)毒素; 硫代乙酰胺; 凝血酶原活動(dòng)度; D-乳酸

慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis,CSH)是由多種因素引起嚴(yán)重的肝臟損害,其具有起病急、病情重、進(jìn)展快、并發(fā)癥多等特點(diǎn),其病死率約為50% ～90%[1-2]。研究表明,慢性重型肝炎可引起腸道通透性增加,誘發(fā)腸源性?xún)?nèi)毒素血癥,其發(fā)生率高達(dá)100%[3]。清毒湯是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)王融冰治療肝病腸源性?xún)?nèi)毒素癥的經(jīng)驗(yàn)方,前期研究證實(shí)清毒湯臨床治療本癥安全有效,本研究擬建立硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)致實(shí)驗(yàn)性大鼠重癥肝損傷模型,通過(guò)觀察清毒湯對(duì)模型大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、內(nèi)毒素、凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin activity,PTA)及D-乳酸的影響,進(jìn)一步研究清毒湯通過(guò)降低腸道通透性治療肝損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠60只,雌雄各半,體質(zhì)量180～200 g,清潔級(jí),動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京) 2012-0001,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物室,實(shí)驗(yàn)期間,動(dòng)物自由攝食、飲水,各組大鼠均喂普通飼料。

1.2 藥物與試劑

清毒湯組成:大黃10 g、枳實(shí)10 g、厚樸10 g、生地黃12 g、茜草9 g,上述藥物購(gòu)自北京同仁堂,由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室煎制,制備成生藥含量1.5 g/mL的水煎劑,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。乳果糖?gòu)自北京科奧科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):ka0009454;硫代乙酰胺購(gòu)自北京科奧科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):S0646;凝血酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司;內(nèi)毒素試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;D-乳酸試劑盒購(gòu)自BioAssay Systems(美國(guó)博士公司)。

1.3 主要儀器

凝血分析儀(ACL-TOP700,美國(guó)貝克曼公司), Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司),日立7600生化儀。

1.4 造模分組及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組和造模組。前8周造模組給予12 mg/kg的TAA灌胃。第9周開(kāi)始,將TAA劑量調(diào)整為36 mg/kg。同時(shí),將造模組隨機(jī)分為模型組、乳果糖組、清毒湯(高、中、低劑量)組。各中藥組每天1次灌服清毒湯濃縮液,劑量為11.9 g/kg、5.95 g/kg、2.98 g/kg。乳果糖組每天1次灌服3.5 mL/kg乳果糖。正常組和模型組給以同等容積的生理鹽水灌服作為對(duì)照。所有組連續(xù)給藥至第12周。

1.5 標(biāo)本制備

第12周末,大鼠禁食12小時(shí)后,用10%水合氯醛按3.5 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉,仰臥位固定,打開(kāi)腹腔,觀察肝臟的色、質(zhì)、形態(tài)和體積。于腹主動(dòng)脈無(wú)菌取血,3 mL注射于抗凝管,2小時(shí)內(nèi)送檢;剩余血注射于無(wú)菌真空采血管,3000 rmp離心10分鐘后,取上清分裝,-80℃保存?zhèn)溆?。取部分肝置?%多聚甲醛和電鏡液中,置-4℃冰箱保存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

ALT采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè),凝血酶原活動(dòng)度采用全自動(dòng)凝血儀檢測(cè),內(nèi)毒素采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè),D-乳酸采用比色法檢測(cè),各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明執(zhí)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各指標(biāo)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn),符合正態(tài)分布,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA);ALT、PTA、D-乳酸組間方差不齊,采用Tamhane's T2檢驗(yàn);內(nèi)毒素組間方差齊性,采用LSD檢驗(yàn)。各種檢驗(yàn)的顯著性水平均設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能血清學(xué)結(jié)果

與正常組比較,模型組大鼠血清ALT活性濃度顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,乳果糖組及清毒湯低、中劑量組大鼠血清ALT活性濃度均顯著下降(P＜0.01),清毒湯高劑量組 ALT明顯下降(P＜0.05)。與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組ALT明顯下降(P＜0.05),清毒湯低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。清毒湯高劑量組ALT顯著高于乳果糖組(P＜0.01)。提示清毒湯具有降低實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠血清ALT活性濃度的作用,其中中劑量組效果比乳果糖組更明顯,低劑量組效果與乳果糖組相當(dāng),高劑量組效果比乳果糖組較差。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性濃度的比較(±s)

注:與正常組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05,cP＜0.01;與乳果糖組比較:dP＜0.05,eP＜0.01。

組別 n ALT(U/L)正常組40.20±7.68模型組 8 135.75±4.56a乳果糖組 8 68.05±8.77c清毒湯低劑量組 8 77.85±10.65c清毒湯中劑量組 8 52.76±8.47cd清毒湯高劑量組 8 102.40±33.6 8 be

2.2 各組大鼠血清內(nèi)毒素含量結(jié)果

與正常組比較,模型組大鼠血清內(nèi)毒素含量顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,乳果糖組及清毒湯低、中劑量組大鼠血清內(nèi)毒素含量均顯著下降(P＜0.01),清毒湯高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組內(nèi)毒素含量顯著下降(P＜0.01),低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),高劑量組內(nèi)毒素含量明顯高于乳果糖組(P＜0.05)。提示大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷內(nèi)毒素血癥模型造模成功,清毒湯具有降低實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠血清內(nèi)毒素含量的作用,其中中劑量組效果最明顯,低劑量組效果與乳果糖組相當(dāng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中內(nèi)毒素含量比較(±s)

注:與正常組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.01;與乳果糖組比較:cP＜0.05,dP＜0.01。

組別 n 內(nèi)毒素(EU/L)正常組70.01±13.41模型組 8 109.33±12.44a乳果糖組 8 92.33±4.56b清毒湯低劑量組 8 92.87±4.63b清毒湯中劑量組 8 76.93±7.58bd清毒湯高劑量組 8 101.87±1.69 8 c

2.3 各組大鼠凝血酶原活動(dòng)度結(jié)果

與正常組比較,模型組大鼠 PTA顯著下降(P＜0.01);與模型組比較,清毒湯高劑量組及乳果糖組明顯升高(P＜0.05),清毒湯低、中劑量組大鼠PTA顯著升高(P＜0.01)。與乳果糖組比較,清毒湯各組PTA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示清毒湯具有提高實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠PTA的作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠凝血酶原活動(dòng)度比較(±s)

注:與正常組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05,cP＜0.01;與乳果糖組比較:dP＜0.05。

組別 n PTA(%)正常組124.29±7.78模型組 7 36.57±8.40a乳果糖組 7 62.43±14.22b清毒湯低劑量組 7 79.29±13.11c清毒湯中劑量組 7 94.14±23.91c清毒湯高劑量組 7 60.43±11.79 7 b

2.4 各組大鼠血清D-乳酸含量結(jié)果

與正常組比較,模型組大鼠血清D-乳酸含量顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,乳果糖組及清毒湯低、中劑量組大鼠 D-乳酸含量均顯著下降(P＜0.01),清毒湯高劑量組D-乳酸含量明顯下降(P＜0.05)。與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組D-乳酸含量明顯下降(P＜0.05),清毒湯低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。清毒湯高劑量組D-乳酸顯著高于乳果糖組(P＜0.01)。提示清毒湯具有降低實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠血清D-乳酸含量的作用,其中中劑量組效果比乳果糖組更明顯,低劑量組效果與乳果糖組相當(dāng),高劑量組效果比乳果糖組較差。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清中D-乳酸含量比較(±s)

注:與正常組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05,cP＜0.01;與乳果糖組比較:dP＜0.05,eP＜0.01。

組別 n D-乳酸(Mm/L)正常組0.41±0.14模型組 8 1.65±0.31a乳果糖組 8 0.73±0.07c清毒湯低劑量組 8 0.79±0.15c清毒湯中劑量組 8 0.60±0.06cd清毒湯高劑量組 8 1.14±0.14 8 be

3 討論

研究表明,腸源性?xún)?nèi)毒素是慢性重型肝炎發(fā)生和病情加重的重要因素[4]。肝組織損傷后產(chǎn)生大量炎性因子作用于腸道,一方面引起腸道菌群失調(diào),另一方面損傷腸道黏膜屏障,造成大量?jī)?nèi)毒素由門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟[5],這些內(nèi)毒素進(jìn)一步刺激加重肝損傷。因此,修復(fù)腸道黏膜屏障,減少內(nèi)毒素進(jìn)入是阻斷疾病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

D-乳酸是胃腸道固有細(xì)菌代謝、裂解的產(chǎn)物,正常情況下很少能被吸收,體內(nèi)亦沒(méi)有快速降解的酶系統(tǒng)。當(dāng)腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)時(shí)可產(chǎn)生大量的D-乳酸,在腸黏膜通透性增加時(shí)進(jìn)入血循環(huán),使血中D-乳酸水平升高。因此監(jiān)測(cè)其水平可及時(shí)反映腸黏膜損傷狀況及腸黏膜通透性[6]。研究表明[7],乳果糖能通過(guò)降低腸道通透性,保護(hù)腸黏膜功能,從而明顯地降低血清內(nèi)毒素水平,對(duì)肝硬化的治療具有較好的療效[8]。

根據(jù)慢性重型肝炎內(nèi)毒素血癥臨床表現(xiàn),當(dāng)隸屬于中醫(yī)學(xué)“疫毒”“疫黃”“臌脹”“黃疸”等病癥的范疇。國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)王融冰教授認(rèn)為慢性重型肝炎內(nèi)毒素血癥的病位在肝及腸絡(luò),病機(jī)乃因虛致實(shí),虛者肝體受損,多臟俱虛,實(shí)者乃毒瘀膠著,毒損腸絡(luò),據(jù)此提出“通腸治肝”的方法,并創(chuàng)制了清毒湯。清毒湯由《傷寒論》中的小承氣湯化裁而來(lái),其中大黃、枳實(shí)、厚樸清熱解毒、通腑攻下,生地黃、茜草滋陰涼血。該方通過(guò)通腑攻下以降低腸道通透性,抑制內(nèi)毒素的產(chǎn)生,從而阻斷內(nèi)毒素對(duì)肝臟的第二次打擊,降低肝損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠血清ALT、內(nèi)毒素、D-乳酸水平較正常組顯著提高,PTA顯著下降。經(jīng)清毒湯治療后,ALT、內(nèi)毒素、D-乳酸均明顯下降, PTA明顯升高,尤其清毒湯中劑量組效果顯著。提示清毒湯對(duì)TAA致實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠具有保護(hù)肝臟,改善肝功能,減少血清中內(nèi)毒素以及D-乳酸含量的作用。推測(cè)其機(jī)制是通過(guò)降低腸道通透性減少內(nèi)毒素及D-乳酸入血,達(dá)到保護(hù)肝臟的作用,但是清毒湯從腸治肝的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

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Effects of Qingdu decoction on endotoxin and D-lactic acid exp ressions in the ratsw ith experimentalsevere liver injury

CAO Wu-bing,GAO Lian-yin,CHE Nian-cong,et al.Capital Medical University School of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100069,China

GAO Lian-yin,E-mail:gly066@sina.com

Objective To observe the effects of Qingdu decoction on the expressions of alanine aminotransferase(ALT),endotoxin,prothrombin activity(PTA)and D-lactic acid in ratswith severe liver injury and explore themechanism of Qingdu decoction on treating Chronic severe hepatitis complicated with endotoxemia.M ethods The severe liver injury rat model was induced by Thioacetamide(TAA),and treated with Qingdu decoction.And then the blood level of ALT,endotoxin,PTA and D-lactic acid were measured.Results The expression levels of ALT,endotoxin and D-lactic acid in the model group were significantly increased and PTA was significantly decreased compared to that of in the Normal Group (P＜0.01).Compared to themodel group,the level of ALT,endotoxin,PTA and D-lactic acid inmiddle and low dose Qingdu decoction groups and Lactulose group were improved significantly(P＜0.05).All indexes expressions except endotoxin in the high dose Qingdu decoction group were decreased significantly (P＜0.05).Compared to the Lactulose group,all indexes expressions except PTA in them iddle doseQingdu decoction group were decreased significantly(P＜0.05).All indexes in the low dose group had no significant difference(P＞0.05),while all indexes expressions except PTA in the high dose group were significantly higher than the Lactulose group(P＜0.05).Conclusion Qingdu decoction can improve liver injury and decrease endotoxin in rats with experimental hepatic injury complicated with endotoxemia, especially in themiddle dose group.Themechanism could be related to the reduction of intestinal permeability.

Liver injury; Endotoxin; Thioacetamide; Prothrombin activity; D-lactic acid

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.015

2015-04-13)

(本文編輯:董歷華)

北京市自然科學(xué)基金(7142023);北京市教委課題(KM2011100025206)

100069 北京,首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[曹吳冰(碩士研究生)、高連印、車(chē)念聰、張秋云、杜宇瓊、羅佳佳(碩士研究生)];首都醫(yī)科大學(xué)校醫(yī)院內(nèi)科(付修文);首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科(王融冰);中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(曹吳冰、高連印、車(chē)念聰、張秋云、杜宇瓊、羅佳佳)

曹吳冰(1990-),女,2013級(jí)在讀碩士研究生。研究方向:中醫(yī)藥防治慢性肝病內(nèi)毒素血癥機(jī)制研究。E-mail:xk.bangbang@163.com

高連印(1966-),女,博士,碩士生導(dǎo)師。研究方向:中醫(yī)藥防治慢性肝病機(jī)制研究。E-mail: gly066@sina.com