王磊 王惠娟 吳凱 胡冬青

·論著·

茵陳蒿湯改善酒精性肝病大鼠肝臟及小腸病變的組織病理學(xué)研究

王磊 王惠娟 吳凱 胡冬青

目的 觀察茵陳蒿湯對酒精性肝病大鼠肝臟及小腸組織病理的改善作用。方法 采用“白酒-吡唑-植物油”混合灌胃法制備大鼠酒精性肝病模型,成模后分別以茵陳蒿湯與雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊(商品名:培菲康)灌胃治療2周,觀察肝與小腸組織病理學(xué)改變,測定各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyltranspetidase,GGT)活性及白蛋白(albumin,ALB)濃度,測定各組大鼠肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量。結(jié)果 與空白組比較,模型大鼠肝組織出現(xiàn)顯著的肝纖維化及肝細(xì)胞脂肪變性,小腸絨毛出現(xiàn)明顯缺損,腺體萎縮,伴炎細(xì)胞浸潤,模型大鼠肝組織Hyp含量及血清GGT活性顯著高于空白組(P＜0.01),血清ALB濃度顯著低于空白組(P＜0.01),但血清ALT及AST活性與空白組無顯著差異(P＞0.05);與模型組比較,茵陳蒿湯組大鼠肝纖維化及肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕,小腸絨毛較完整,腺體排列較規(guī)則,肝組織Hyp含量及血清GGT活性顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);雙歧桿菌組大鼠小腸黏膜損傷顯著減輕,但肝組織病理改善不明顯,肝組織Hyp含量與模型大鼠無顯著差異(P＞0.05)。結(jié)論 茵陳蒿湯能夠有效減輕酒精性肝病大鼠肝纖維化與脂肪變性,同時(shí)顯著改善小腸黏膜損傷。

茵陳蒿湯; 酒精性肝病; 肝纖維化; 腸黏膜損傷; 雙歧桿菌三聯(lián)活菌

酒精性肝病是由于長期大量飲酒所致的肝臟疾病,初期通常表現(xiàn)為脂肪肝,進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化[1]。長期酒精攝入不僅造成肝細(xì)胞損傷,還能破壞腸上皮屏障,使腸道通透性增加,導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥,進(jìn)一步加重肝損傷[2]。茵陳蒿湯是中醫(yī)清利濕熱的代表方劑,也是現(xiàn)代中醫(yī)臨床治療酒精性肝病的常用方劑,本文從病理形態(tài)學(xué)角度探討茵陳蒿湯對酒精性肝病大鼠肝臟及小腸組織病理的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠,SPF級,體質(zhì)量(180±15)g,購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號:SCXK(魯)20090001。于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),普通顆粒飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室條件:溫度: (25±2)℃,濕度:50%～75%。

1.1.2 材料與試劑 56度鑫帝牌北京二鍋頭白酒(北京鑫帝酒業(yè)公司白酒分公司)、玉米油(山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司)均購自超市,吡唑(Sigma-Aldrich公司,批號:BCBB5422V),谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyltranspetidase,GGT)檢測試劑盒(南京建成生物公司,批號:20100117)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 茵陳蒿湯(茵陳蒿12 g、梔子9 g、大黃9 g)及對照藥物雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊(商品名:培菲康,上海信誼藥廠有限公司,以下簡稱雙歧桿菌,批號:03/20100814)均購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,茵陳蒿湯由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬藥劑科制備成水煎滅菌溶液備用,雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊臨用前制備混懸液。

1.2 模型制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組:空白對照組(6只)與模型組(44只),模型組采用改良的白酒—吡唑—植物油灌胃法[3],即:二鍋頭白酒10 m L/(kg·d)+玉米油 2 m L/(kg·d)+吡唑25 mg/(kg·d)混合物每天灌胃1次,共12周。于實(shí)驗(yàn)第8周末、第10周末分別處死模型組大鼠各3只檢查肝纖維化成模情況。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù)

模型組大鼠于實(shí)驗(yàn)第13周隨機(jī)分為模型對照組7只、茵陳蒿湯組8只、雙歧桿菌組7只,茵陳蒿湯組及雙歧桿菌組灌胃量為10 mL/(kg·d),給藥2周;模型對照組按10 mL/(kg·d)每天灌胃生理鹽水1次。各組大鼠均灌胃2周。

1.4 樣本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組大鼠按2 mL/kg體重劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉,麻醉后仰臥位固定,打開腹腔,經(jīng)下腔靜脈放血后摘取肝臟,于肝右葉中部切取1.0 cm×1.0 cm大小肝組織2塊,4%中性甲醛溶液固定24～48小時(shí),制備石蠟包埋肝組織病理切片。同時(shí)于回盲部向上2 cm處切取1.5 cm小腸,生理鹽水沖洗后沿長軸剖開,4%中性甲醛溶液固定,制備石蠟包埋病理切片。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 大鼠一般情況 包括動(dòng)物精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤度、進(jìn)食量、體重等。

1.5.2 血清肝功能檢測 采用全自動(dòng)生化儀檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性及白蛋白(albumin,ALB)濃度,手工法檢測血清谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyltranspetidase,GGT)活性。

1.5.3 肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量檢測 采用改良的Jamall氏方法[4]。

1.5.4 肝組織病理學(xué) 采取兩種染色方法觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化:(1)HE染色:主要觀察肝細(xì)胞脂肪變、肝纖維化及炎細(xì)胞浸潤等;(2)Masson三色染色:觀察肝纖維化情況。

1.5.5 小腸組織病理學(xué) HE染色觀察各組大鼠小腸組織病理學(xué)改變,主要包括小腸絨毛缺損、黏膜下腺體排列及炎細(xì)胞浸潤等。

表1 各組大鼠血清肝功能比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.01;與模型組比較,bP＜0.05。

組別 n ALT(U/L) AST(U/L) ALB(g/L) GGT(U/L) 55.77±19.31 77.8±9.9 150.2±17.6 23.9±1.3 17.38±4.71模型組 7 103.0±53.8 170.7±69.8 19.7±1.6a60.47±16.39a茵陳蒿湯組 8 83.1±21.4 167.5±45.4 23.0±3.4b23.58±10.05b雙歧桿菌組 7 90.9±29.8 160.0±53.0 24.3±1.7a空白組6

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白組大鼠毛發(fā)光澤,體質(zhì)量增加,活動(dòng)自如,食量及大便正常,無死亡。模型組大鼠造模期間飲食逐漸減少,皮毛疏松無光澤,易激惹,大便稀溏,小便黃,后期體質(zhì)量下降,精神不振。

2.2 各組大鼠血清ALT、AST、GGT活性及ALB含量比較

生化檢測顯示,各組大鼠血清ALT、AST活性無顯著差異。與空白組比較,模型組大鼠血清GGT活性顯著升高(P＜0.01),同時(shí)血清ALB濃度顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,茵陳蒿湯組大鼠血清GGT活性顯著降低(P＜0.05),茵陳蒿湯組及雙歧桿菌組大鼠血清ALB濃度顯著升高(P＜0.05),見表1。

2.3 各組大鼠肝組織羥脯氨酸含量比較

與空白組比較,模型組、茵陳蒿湯組、雙歧桿菌組大鼠肝組織羥脯氨酸含量顯著增高(P＜0.01);與模型組比較,茵陳蒿湯組大鼠肝組織羥脯氨酸含量顯著降低(P＜0.01),而與雙歧桿菌組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。

表2 各組大鼠肝組織羥脯氨酸含量比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.01,與模型組比較,bP＜0.01。

組別 n 肝重(mg) Hyp(μg/g濕肝) 6 102.00±1.89 164.32±13.37模型組 7 101.14±2.19 633.79±114.86a茵陳蒿湯組 8 100.67±2.42 485.72±64.72ab雙歧桿菌組 7 101.17±1.60 625.80±133.35空白組a

2.4 肝組織病理

HE染色觀察,空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索呈放射狀整齊排列,肝竇無擴(kuò)張,無明顯炎細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肝細(xì)胞索排列紊亂,肝細(xì)胞可見明顯的大泡性脂肪變性,匯管區(qū)較多炎細(xì)胞浸潤,匯管區(qū)膠原纖維顯著增生并向小葉內(nèi)延伸,部分小葉內(nèi)可見粗大的纖維間隔形成。茵陳蒿湯組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕,肝細(xì)胞索排列較整齊,小葉內(nèi)散在肝細(xì)胞脂肪變性,匯管區(qū)及小葉內(nèi)無明顯的纖維間隔。雙歧桿菌組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性及纖維化較模型組有所減輕,但肝細(xì)胞索仍排列紊亂,見圖1。Masson染色觀察,正常大鼠肝組織僅在匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見少量藍(lán)色的Ⅰ型膠原,模型大鼠肝組織有較多粗大的膠原纖維自匯管區(qū)向小葉內(nèi)延伸,部分形成橋接樣的纖維間隔。茵陳蒿湯組大鼠肝組織藍(lán)色的膠原纖維較模型組明顯減少,無橋接樣纖維間隔;雙歧桿菌組肝組織膠原纖維較為纖細(xì),但橋接樣間隔仍較明顯,見圖2。

2.5 小腸病理

HE染色觀察,空白組大鼠小腸絨毛排列整齊,無缺損,黏膜下腺體大小一致,無腺體增生,無明顯炎細(xì)胞浸潤。模型大鼠小腸絨毛變短,排列稀疏,黏膜下腺體萎縮,伴炎細(xì)胞浸潤。茵陳蒿湯組大鼠小腸絨毛較完整,缺損不明顯,黏膜下腺體排列較規(guī)則。雙歧桿菌組大鼠小腸絨毛排列較整齊,黏膜下腺體較規(guī)則,無明顯炎細(xì)胞浸潤,見圖3。

3 討論

本研究結(jié)果顯示,模型大鼠血清GGT活性顯著升高,同時(shí)血清ALB濃度顯著降低,但血清ALT、AST活性與空白組大鼠比較并無顯著性差異,提示肝細(xì)胞的炎癥、壞死并非該模型成模后的主要病變。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),酒精度數(shù)較高(60°)或灌胃量較大時(shí),大鼠血清ALT、AST活性可出現(xiàn)明顯升高,但前期死亡率極高,病理檢測發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞壞死明顯,不會形成穩(wěn)定的脂肪變及后期的肝纖維化。因此,若想提高酒精性肝病模型制備成功率,應(yīng)該采用較低度數(shù)的白酒、較少灌胃量及灌胃次數(shù)、適當(dāng)延長造模時(shí)間。大鼠血清GGT活性顯著升高、同時(shí)血清ALB濃度顯著降低提示造模較成功,單純血清ALT、AST活性升高并非酒精性脂肪肝、肝纖維化的必備條件。結(jié)合肝組織病理學(xué)觀察也可以發(fā)現(xiàn),本模型復(fù)制的酒精性肝病突出的特點(diǎn)是肝細(xì)胞脂肪變伴有纖維化,小葉內(nèi)的炎細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞壞死并不明顯。

本研究證實(shí),“白酒—吡唑—植物油”混合灌胃法制備的酒精性肝病大鼠不僅存在肝臟病變,同時(shí)還存在明顯的小腸黏膜病理學(xué)改變,主要表現(xiàn)為小腸絨毛明顯變短,排列稀疏,黏膜下腺體萎縮,伴炎細(xì)胞浸潤。雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊為復(fù)方制劑,其組份為長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌,主要治療因腸道菌群失調(diào)引起的急慢性腹瀉、便秘,以及輔助治療慢性肝病內(nèi)毒素血癥。有研究表明,雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊能夠改善肝硬化大鼠的肝臟及小腸黏膜的組織損傷[5],因此本研究以該藥為對照藥,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊能夠較好地改善酒精性肝病小腸損傷,與既往研究結(jié)果一致[5-6],但雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊對肝纖維化及肝細(xì)胞脂肪變的治療作用不明顯。

茵陳蒿湯是中醫(yī)清利肝膽濕熱的代表方,現(xiàn)代中醫(yī)臨床廣泛用于治療酒精性與非酒精性肝病。前期研究發(fā)現(xiàn),茵陳蒿湯對大鼠肝纖維化具有較好的治療作用[7]。本研究首次發(fā)現(xiàn),茵陳蒿湯不僅能夠減輕酒精性肝病大鼠肝細(xì)胞脂肪變及肝纖維化,還能較好地改善酒精造成的小腸黏膜損傷。肝組織羥脯氨酸測定是評價(jià)肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn),綜合肝組織羥脯氨酸含量檢測判定,茵陳蒿湯干預(yù)“白酒-吡唑-植物油”混合灌胃法制備大鼠酒精性肝病的整體療效優(yōu)于雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊,提示茵陳蒿湯對酒精性肝病具有多環(huán)節(jié)的作用特點(diǎn),通過腸道通透性、血漿內(nèi)毒素等環(huán)節(jié)的動(dòng)態(tài)研究,有望進(jìn)一步揭示茵陳蒿湯對酒精性肝病的作用機(jī)制,明確其具體的作用靶點(diǎn)。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.酒精性肝病診療指南(2010年修訂版)[J].中華肝臟病雜志,2010,18 (3):167-170.

[2] Rao RK,Seth A,Sheth P.Recent advances in alcoholic liver disease.I.Role of intestinal permeability and endotoxemia in alcoholic liver disease[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2004,286(6):881-884.

[3] 王磊,季光,鄭培永,等.大鼠酒精性肝纖維化復(fù)合模型的建立[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2006,4(3):281-284.

[4] 王磊,劉平,慕永平,等.二甲基亞硝胺大鼠肝纖維化中醫(yī)方證研究[J].中醫(yī)雜志,2006,47(12):929-932.

[5] 卜淑蕊,關(guān)志明,閆柱.調(diào)整腸道菌群對肝硬化大鼠肝組織學(xué)的影響[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2001,13(2):83-84.

[6] 范妮,田字彬,孔心涓,等.益生菌對肝硬化患者腸黏膜通透性的影響[J].世界華人消化雜志,2009,17(36):3745-3748.

[7] 王磊,劉平,慕永平,等.清熱利濕與益氣古典方劑逆轉(zhuǎn)二甲基亞硝胺大鼠肝硬化的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究[J].自然科學(xué)進(jìn)展,2007,17(8):1026-1035.

Effect of Yinchenhao decoction on both hepatic and intestinal histopathology in rats w ith alcoholicliver disease

WANG Lei,WANG Hui-juan,WU Kai,et al. Department of Hepatology,the affiliated hospital ofShandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250011,China

WANG Lei,E-mail:wanglei.2006@126.com

Objective To investigate the effect of Yinchenhao decoction on both hepatic and intestinal histopathology in rats with alcoholic liver disease.M ethods Rats model with alcoholic liver disease was established by“Liquor-pyrazole-vegetable oil”mixture gavaging for12 weeks.After2 weeks treatmentwith either Yinchenhao decoction or Bifidobacterium,Lactobacillus and Enterococcus Capsules (Bilico),histopathological observation of hepatic and intestinal lesions were conducted by microscopy and serum activities of Alanine aminotransferase (ALT),Aspartate aminotransferase (AST) , Glutamyltranspetidase(GGT),ALB concentration and hepatic hydroxyproline(Hyp)content were detected.Results Compared to the control group,themodel rats showed significant hepatic fibrosis and steatosis accompanied by shorter and sparsely arranged intestinal villi,glandular atrophy and inflammatory cell infiltration.The content of Hyp and activity of serum GGT ofmodel rats was significantly higher than that of the control group(P＜0.01),while the concentration of serum ALB was significantly lower than the control group(P＜0.01).However,there was no significant difference in serum ALT and AST activity between the control group and themodel group(P＞0.05).Compared to themodel group,hepatic fibrosisand steatosis in Yinchenhao decoction-treated group were significantly reduced withmore complete intestinal villi,more regular arranged submucosal glands aswell as significantly decreased contentof hepatic Hyp and serum GGT activity(P＜0.05,P＜0.01).Bilico-treated groups showed obvious improvement only in intestinalmucosal injuries,not in hepatic histopathology and Hyp content.Conclusions Yinchenhao decoction can effectively alleviate hepatic fibrosis and steatosis as well as the intestinalmucosal injury in rats with alcoholic liver disease.

Yinchenhao decoction; Alcoholic liver disease; Liver fibrosis; Intestinal mucosal injury; Bifidobacterium,Lactobacillus and Enterococcus Capsules

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.014

2014-06-27)

(本文編輯:董歷華)

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃(2007-060);山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2009YY021)

250011 濟(jì)南,山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病科(王磊、胡冬青),病理科(吳凱);山東中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院消化內(nèi)科(王惠娟)

王磊(1973-),博士,副主任醫(yī)師。研究方向:中醫(yī)藥防治慢性肝病。E-mail:wanglei.2006@ 126.com