王艷 劉艷麗

流行性感冒(influenza，簡稱流感)是由流感病毒引起的急性發(fā)熱性呼吸道傳染病，根據(jù)核糖蛋白抗原不同分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒。其中甲(A)型最常見，可廣泛流行并人畜共患，同時會發(fā)生不定時的突變而衍生出新的病毒株，乙(B)型也會發(fā)生流行，但癥狀較輕，丙(C)型主要以散發(fā)出現(xiàn)，后兩種病毒無再分亞型。流感病毒毒株抗原易變性是流感肆虐不止的關(guān)鍵所在，流感蔓延的機(jī)制雖未能完全破解，當(dāng)前流感的防治是個尚未解決的難題，一些抗病毒藥物中僅金剛烷胺和甲基金剛烷胺對甲型流感病毒有效，因其作用于甲型流感病毒的脫殼步驟，作用對象為M2蛋白。但這兩種藥物有較多的副作用，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，因此必須慎用。目前接種流感疫苗是預(yù)防流感和控制其流行的一種最有效的措施。本文對當(dāng)前流感疫苗的研究進(jìn)程做簡要回顧。

1 流感疫苗發(fā)展進(jìn)程回顧及現(xiàn)狀

1937年流感病毒在雞胚中培養(yǎng)成功;

1941年美國首次批準(zhǔn)使用流感病毒滅活疫苗;

1943年美國開始在軍隊(duì)中使用并證實(shí)有效;

1945年美國開始廣泛應(yīng)用;

1958年有人采用超速離心和層析技術(shù)研究成功進(jìn)一步純化的雞胚全病毒滅活疫苗，多種裂解劑的研究使流感病毒裂解疫苗研制成功;

1968年裂解疫苗在美國首次被批準(zhǔn)使用;

1976年英國首先在裂解疫苗基礎(chǔ)上又研制出毒粒亞單位(HA和NA)疫苗;

1980年英國首次批準(zhǔn)使用，滅活流感疫苗從而擴(kuò)展到其他國家。

2003年美國批準(zhǔn)在5至49歲健康人群中主動免疫接種減毒流感疫苗(LAIV)，流感活疫苗成為預(yù)防流感的一種重要新選擇。

1.1 目前我國市場應(yīng)用的流感疫苗

目前我國流感疫苗市場的疫苗有國產(chǎn)和進(jìn)口裂解疫苗、適合于12歲以下兒童接種的亞單位疫苗、全病毒滅活疫苗(此疫苗不良反應(yīng)較大，12歲以下兒童不能接種)三種類型［1-3］。

1.1.1 流感全病毒滅活疫苗:經(jīng)國家藥品管理部門批準(zhǔn)的流感病毒接種雞胚尿囊腔中，對收獲的尿囊液進(jìn)行滅活和無菌處理［4］，再采用離心或柱層析方法進(jìn)行濃縮、純化得到病毒原液，經(jīng)過檢測合格后進(jìn)行包裝即為流感全病毒滅活疫苗。由于其不良反應(yīng)報道較多限制了其應(yīng)用

1.1.2 流感病毒裂解疫苗:經(jīng)國家藥品管理部門批準(zhǔn)的流感病毒株、在全病毒滅活疫苗基礎(chǔ)上，將純化后的病毒進(jìn)行裂解，超濾濃縮后的單價病毒合并液可采用柱色譜法或蔗糖密度區(qū)帶離心法進(jìn)行純化，純化后的病毒裂解液經(jīng)除菌過濾后，并加入適宜濃度的硫柳汞作為防腐劑，根據(jù)各單價病毒原液的血凝素含量，將各型流感病毒按同一血凝素含量進(jìn)行配制。所以，該類型疫苗的使用范圍持續(xù)擴(kuò)大，成為當(dāng)前流感疫苗市場的主流。

1.1.3 亞單位型流感滅活疫苗:是在在裂解疫苗的基礎(chǔ)上，通過加入恰當(dāng)?shù)牧呀庠噭┎⑦x擇合適的裂解條件，將流感病毒膜蛋白毒粒亞單位(HA)和表面抗原(NA)裂解下來，然后進(jìn)行純化。亞單位型流感滅活疫苗進(jìn)行人體接種后可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，其免疫效果與裂解疫苗相同，且具有較好的安全性，可用于兒童。但亞單位型流感滅活疫苗不能使接種者產(chǎn)生分泌性球蛋白，且對異型病毒的感染效果較差。

1.2 我國尚未上市的流感減毒活疫苗 流感減毒活疫苗由美國率先研究并獲得美國上市許可，其減毒活疫苗是三價冷適應(yīng)流感病毒甲、乙型疫苗，由甲型H1N1、甲型H3N2和乙型病毒以相當(dāng)?shù)臒晒饩劢箚挝?FFU)劑量組成。生產(chǎn)用毒株需要每年由國家衛(wèi)生部門推薦的流行抗原進(jìn)行匹配更新。該疫苗是通過一個簡單的注射裝置噴入鼻腔，易于操作，并且比需要注射使用的滅活流感疫苗更容易被兒童所接受。美國臨床觀察證明，該疫苗免疫原性和安全性與流感滅活疫苗相似，在兒童組中，其所對應(yīng)的病毒株和變異株的免疫效果略優(yōu)于滅活疫苗。流感減毒活疫苗的制備方式是用單獨(dú)的疫苗毒種接種9～11 d的無特定病原體SPF雞胚，產(chǎn)生大量的6∶2重配株的單價疫苗。通過2～3 d的培養(yǎng)后，收集雞胚尿囊液，離心澄清并加入緩沖液穩(wěn)定，得到大量的單價疫苗。按照配方，3種單價毒株和SPG溶液混合一定比例濃度并填充至噴鼻腔裝置中。目前我國企業(yè)如中國生物技術(shù)、天壇生物等公司也在積極研究開發(fā)流感減毒活疫苗。

2 新型流感疫苗研發(fā)現(xiàn)狀

新型的流感疫苗種類繁多，主要的研究方向?qū)⑿滦偷牧鞲幸呙绾喪鰹槿悺?/p>

2.1 針對毒種變異方面開發(fā)的流感疫苗 多價疫苗的開發(fā)是個必然的趨勢。流感疫苗從1978年前的“二價”苗到現(xiàn)在的“三價”苗已經(jīng)歷了35年。然而，自從2001-2002流感季節(jié)以來，2種不同的乙型流感(Victoria和 Yamagata)一直合并流行［5-9］，“四價”苗的出現(xiàn)，有助于預(yù)防兩種A型病毒，并覆蓋了第二種B型病毒株，保護(hù)針對2種A株和2種B株流感病毒株的感染，降低兒童、成人、老年人的發(fā)病率。證明多價疫苗研發(fā)的必然趨勢。

毒株抗原性變異導(dǎo)致流感疫苗病毒株每年都需更換，但從1933年首次分離以來，M2蛋白的基因序列沒有發(fā)生變化。而近來的研究表明，將M2蛋白通過桿狀病毒載體在sf9細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)腹腔注射BLAB/c小鼠，各項(xiàng)指標(biāo)均表明，以M2為成分的流感疫苗可以保護(hù)小鼠免受同型或異型流感病毒的致死攻擊。這就為科學(xué)家們提供了一個思路:用M2蛋白作為疫苗成分可預(yù)防所有的甲型流感病毒。

2.2 新的培養(yǎng)基質(zhì)開發(fā)的流感疫苗 禽流感施虐對傳統(tǒng)流感疫苗培養(yǎng)基質(zhì)雞胚供應(yīng)的巨大沖擊，使傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)的方式受到雞胚來源不足的制約，難以在短時間內(nèi)生產(chǎn)足夠的疫苗以滿足潛在流行或大流行的防控需求。改變傳統(tǒng)的疫苗培養(yǎng)基質(zhì)的研究工作一直在進(jìn)行，利用雞胚細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞以及人二倍體細(xì)胞進(jìn)行流感病毒的培養(yǎng)研究均取得了較大的突破。MDCK細(xì)胞生產(chǎn)制備流感疫苗平臺技術(shù)已經(jīng)形成并正在推廣［10］，采用細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗在安全性和免疫性上與雞胚法相當(dāng)，而在經(jīng)濟(jì)性和時效性上則遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出，顯示了良好的發(fā)展前景。

基因工程疫苗大體分為四類，一類是利用基因工程方法刪除與毒力有關(guān)的基因從而制備的基因缺失疫苗;另一類是將保護(hù)性抗原基因連接到相關(guān)載體上使之表達(dá)的載體疫苗;第三類是基因工程亞單位疫苗，HA基因工程疫苗是目前研究最多的基因工程亞單位疫苗;第四類疫苗為利用反基因操作技術(shù)制備的反基因工程疫苗。采用基因工程方法制備疫苗的技術(shù)日益成熟，使用該技術(shù)可以快速提煉有效成分，應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)。

2.3 針對提高疫苗安全性及免疫原性開發(fā)的流感疫苗 疫苗佐劑應(yīng)用非常廣泛，為提高疫苗的免疫原性并在流感大流行時節(jié)約抗原量，佐劑的應(yīng)用得到國內(nèi)外的認(rèn)可。傳統(tǒng)的疫苗佐劑仍是氫氧化鋁和磷酸鋁，但近年來，科學(xué)家們對疫苗佐劑的設(shè)計(jì)、研制和開發(fā)取得了許多進(jìn)展，一些優(yōu)秀的佐劑諸如MF59、LTK63、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)黏膜佐劑［11-13］、皂素佐劑等廣泛應(yīng)用于疫苗研究。各項(xiàng)研究表明，佐劑疫苗在流感流行的大環(huán)境下，是增加疫苗的供應(yīng)量提高免疫效果一個非常明顯有效的方法。

類病毒顆粒疫苗，最早，日本人稱該類疫苗為virosome vaccine［14］，也可稱之為 MDP-virosome vaccine。目前，很多生物技術(shù)公司采用基因工程等新技術(shù)進(jìn)行該類疫苗的研發(fā)。美國Greffex公司宣布采用GREVAXTM技術(shù)，通過經(jīng)改造的腺病毒載體，研發(fā)新型流感疫苗;Protein Science公司宣布采用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)技術(shù)［15，16］，研發(fā)新型流感疫苗;加拿大 Medicago公司宣布研制出H7N9病毒樣顆粒(virus-like particle，VLP)疫苗［17-19］。該類疫苗的多處于臨床研究階段，國內(nèi)未見公開報道，同樣也是國內(nèi)流感疫苗市場未來幾年研發(fā)的方向。

核酸疫苗是將編碼一種免疫原基因的核酸克隆人表達(dá)載體［20］，該載體在細(xì)菌中擴(kuò)增，質(zhì)粒DNA純化后用于機(jī)體免疫，在細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白，引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。目前，流感疫苗的目的基因主要針對NP蛋白和HA，利用DNA重組技術(shù)，可直接提取HA DNA和NA DNA用于機(jī)體免疫，動物試驗(yàn)結(jié)果表明，核酸疫苗對保護(hù)動物抵御流感病毒的感染是一種既經(jīng)濟(jì)又有效的方法［21］，但該類疫苗在人體上的應(yīng)用還需要長期周密的研究和評估。

十余年以來，我國先后經(jīng)歷了多次流感疫情的考驗(yàn)，從 2003年人感染 H5N1禽流感、2009年甲型H1N1流感大流行到此次H7N9禽流感疫情，無論國際還是國內(nèi)，疫苗研發(fā)能力顯著提高、研發(fā)周期明顯縮短。然而，我國疫苗基礎(chǔ)研究薄弱，技術(shù)儲備不足，與歐美發(fā)達(dá)國家在創(chuàng)新能力、研發(fā)投入力度和技術(shù)水平等方面仍存在較大差距。我國人口基數(shù)大，衛(wèi)生條件相對落后，又是流感大流行的主要爆發(fā)地，因此，及時研發(fā)新型疫苗，做好技術(shù)準(zhǔn)備，以提高疫苗生產(chǎn)能力，這是防控潛在流行或大流行的關(guān)鍵措施，對保障公眾健康、維護(hù)社會經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定具有重要意義。

1 王敏文，王志剛，范宇紅，等.流行性感冒純化疫苗的研.中國生物制品學(xué)雜志，2002，6:164.

2 普洛特金，懷特，歐根森，等主編.疫苗學(xué).第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011.318.

3 紀(jì)文艷，盧莉，呂敏，等.中國首批次甲型H1N1流感疫苗上市后安全性與保護(hù)效果的研究.中華流行病學(xué)雜志，2010，10:120-123.

4 王華慶，隨海田，梁曉峰.META分析在疫苗評價中的應(yīng)用.中國計(jì)劃免疫雜志，2007，8:600-603.

5 Belshe RB，Coelingh K，Ambrose CS，et al.Efficacy of live attenuated influenza vaccine in children against influenza B viruses by lineage and antigenic similarity.Vaccine，2010，28:2149-2156.

6 Beran J，Wertzova V，Honegr K，et al.Challenge of conducting a placebo controlled randomized efficacy study for influenza vaccine in a season with low attack rate and a mismatched vaccine B strain:a concrete example.BMC Infect Dis，2009，9:2.

7 Camilloni B，Neri M，Lepri E，et al.An influenza B outbreak during the 2007/2008 winter among appropriately immunized elderly people living in a nursing home.Vaccine，2012，28:7536-7541.

8 O’Brien MA，Uyeki TM，Shay DK，et al.Incidence of outpatient visits and hospitalizations related to influenza in infants and young children.Pediatrics，2004，113:585-593.

9 Robinson HL.Nucleic acid vaccine:an overview.Vaccine，1997，15:785-787.

10 郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)，1997，5:213.

11 沈月雷.昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組流感血凝素疫苗的免疫效果評價.國外醫(yī)學(xué)(預(yù)防、診斷、治療用生物制品分冊)，1997，20:89.

12 鄭秋君.合成的重組流感疫苗誘導(dǎo)的長期免疫力和株間交叉保護(hù)作用.醫(yī)外醫(yī)學(xué)(預(yù)防、診斷、治療用生物制品分冊)，1997，20:39.

13 周慧，盛賢，平文祥.佐劑的研究進(jìn)展.生物技術(shù)，2004，6:101.

14 Viola S，Vicente D，Andreas W.Safety of MF-59TM adjuvant.Vaccine，2008，12:3209-3222.

15 李萍，嚴(yán)家新.DNA疫苗研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)預(yù)防、診斷、治療用生物制品分冊，1995，18:100-104.

16 楊琳.流感血凝素DNA疫苗誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的檢定.國外醫(yī)學(xué)(預(yù)防、診斷、治療用生物制品分冊)，1998，20:36.

17 Bot A，Bot S，Garcia SA.DNA immunization of newborn mice with a plasmid expressingnucleoprotein of influenza virus.Virallmmunol，1996，9:207-210.

18 Shal Z，Vincent MJ，Compans RW.Enhancement of mucosal immune responsestothe in fluenzavirus HA protein by alternative approaches to DNA immunization.Immunobiology，1999，200:21-30.

19 Mei L，Tang Q，Cui YM，et al.Changes in and shortcomings of drug stockpiling，vaccine development and related policies during outbreaks of avian influenza A H5N1，H1N1，and H7N9 among humans(Review).Drug Discov Ther，2013，7:95-100.

20 胡月梅，譚北營，吳楊生，等.國產(chǎn)流行性病毒裂解疫苗臨床安全性與免疫原性評價.疾病控制雜志，2006，386-388.

21 張杰民，劉德平，趙秀昌，等.一種澳大利亞流行性感冒病毒裂解疫苗臨床反應(yīng)及血清學(xué)效果觀察.預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2008，14:593-595.