賈秀雙，王 靜，梁興國

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

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一種檢測近緣物種混合樣品的新方法*

賈秀雙，王 靜，梁興國**

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

結合雙重PCR(Duplex PCR，dPCR)和擴增產物熔點的測定，建立了一種定量分析近緣物種混合樣品中各物種相對含量的新方法。即針對混合樣品中2種物種的DNA序列，各自設計高特異性引物，使2種物種的DNA同時進行PCR擴增而互不干擾，且擴增產物的熔點有足夠的差別(> 1℃)；然后進行PCR擴增并測得不同溫度下PCR產物同熒光染料結合后的熒光值；該熒光值對溫度進行微分所得微分曲線上會產生2個峰(在兩物種各自PCR產物熔點溫度處)，根據(jù)這2個峰的峰高比值同其相對含量的關系，即可完成對各物種含量的定量分析。本研究以長鰭和黃鰭金槍魚的混合樣品為例，對此方法的可行性進行了驗證。結果表明，2種成分的含量比與對應峰值比之間線性關系良好；當混合樣品中含有10%以上長鰭金槍魚或5%以上黃鰭金槍魚時，能夠進行較準確的定量檢測，證明了本方法切實可行。這一新方法解決了在混合樣品中難以準確定量物種的難題，在食品安全和基因診斷領域有廣泛的應用前景。

雙重特異性PCR；熔點；混合樣品；定量分析；物種鑒定

不同物種在商品價值、品質、潛在過敏原種類和受保護程度等方面存在較大的差異，因此亟需建立一種簡單、快速、可靠、重復性高的檢測方法來保障消費者的權益，規(guī)范食品市場和保護瀕危物種。然而混合樣品，尤其是近緣混合樣品的存在，使很多分子檢測方法的實際應用受到了很多限制。如FINS中使用的通用引物可能會同時擴增混合樣品中的多種成分，造成測序結果混亂[1]；限制性內切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)和單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)雖然可定性檢測不同屬、科，甚至不同目的混合物種，但在區(qū)分近緣物種的應用方面，其結果更易受種內變異的影響[2-4]，且序列間的高度相似性限制了它們的應用[5]；多重PCR能夠對遠緣物種混合樣品中的組分進行定性分析，但反應體系優(yōu)化和電泳分析產物耗時長，不適于高通量快速篩選[6]。由于近緣物種模板DNA的序列高度相似，采用多重PCR區(qū)分近緣物種時，引物設計困難，很難避免假陽性結果出現(xiàn)[7-8]。采用特異性探針和熒光定量PCR，雖能區(qū)分近緣物種及其混合樣品，但檢測成本較高，且不能對混合樣品中的物種進行準確定量分析[9]?？梢?，目前對于混合樣品，尤其是近緣物種混合樣品的定量分析，仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

利用熒光定量PCR儀測定的PCR產物熔解曲線(特定染料同dsDNA作用發(fā)出熒光)，可對病原菌進行定性檢測[10-12]，也可用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測[13]。有報道認為此法與探針法檢測的準確度相當[14]，且不易產生假陽性[15]。但對于近緣物種混合樣品的定量檢測還未見報道?？紤]到PCR產物熔點一般只同其GC含量有關，而某一PCR產物的含量同其熔解曲線一次微分后的峰值呈正相關，作者設想，可根據(jù)雙重PCR的2個產物的相應峰高的比值隨物種含量的變化情況來定量分析近緣物種的混合樣品。本文以近緣物種長鰭和黃鰭金槍魚的混合樣品為例，建立了雙重PCR與熔點分析相結合(Combination of duplex PCR andTmanalysis，dPCR-Tm)的方法，實現(xiàn)對混合樣品的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準樣品 經過形態(tài)學鑒定的長鰭金槍魚(Albacore,n=11)、黃鰭金槍魚(Yellowfin tuna,n=20)和大目金槍魚(Bigeye tuna,n=3)，捕撈于美屬薩摩亞島，由中國海洋大學水產學院高天翔教授提供。

混合樣品 購于青島某超市的長鰭金槍魚和黃鰭金槍魚魚肉(FINS法鑒定)按不同比例混合制備混合樣品。

引物由英濰捷基公司合成；SYBR@Select Master Mix(2 ×) 購于Invitrogen公司；苯酚、氯仿和乙醇等購自國藥集團；瓊脂糖G10(Biowest)；Genegreen DNA染料購于北京天根公司；熒光定量PCR儀(Illumina公司)，伯樂凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 樣品DNA提取

標準樣品和人工混合樣品均采用改良的苯酚氯仿法[16]提取樣品DNA。

1.3 引物設計

我們應該遵照我們本性的意愿而生活，即應該追求過一種優(yōu)美而高尚的生活，要能做到這一點，就是要促使自己的內在靈魂合乎自然地生長起來。但是，人是不能靠自己孤獨的生活而促使內在靈魂的生長的，“在本性上而非偶然地脫離城邦的人，他要么是一位超人，要么是一個惡人?！@種人就仿佛棋盤中的孤子?！盵2](P6)只有在政治共同體的活動中，人們才具有了過好生活的最終可能性。

選取GenBank上登錄的金槍魚屬(Thunnus)、鰹魚屬(Katsuwonus)和舵鰹屬(Scombridae)的15個線粒體全基因序列(登錄號： GU256526.1，AB101291.1，GU256528.1，NC014059.1，GU256523.1，GU256524.1，NC008455.1，AY302574.2，HQ425780.1，JN086154.1，AB101290.1，AB103467.1，AB105165.1，AB103468.1，NC005318.1)，運用NCBI Blast進行序列同源性比對分析，在進化速率適中的基因中選取種間差異性較大的部分，針對長鰭(A)和黃鰭金槍魚(Y)設計特異性引物，并運用Primer Premier 6.0軟件對引物性能進行評估。

1.4 熒光定量PCR反應和產物熔解曲線測定

熒光定量PCR的反應體系(10μL)為：5μL通用PCR反應預混液(SYBR@Select Master Mix(2 ×) Invitrogen產品)；引物(10 μmol/L)各0.2μL；模板 1μL(約4ng)。 反應條件：50℃UDG處理 2min；95℃ 預變性 2min；98℃ 變性 15s， 一定溫度下(55、58或62℃) 退火 30s，72℃ 延伸 30s, 78℃ 10s 讀取熒光，30～35個循環(huán)。熔解曲線測定條件：98℃ 15s變性后緩慢降溫至65℃(降溫速率0.2℃/s)，保持30s，然后緩慢升溫至95℃(升溫速率0.2℃/s)，并在升溫過程中測量不同溫度下的熒光值。測量后用儀器自帶軟件進行一次微分，并進行相關分析。

1.5 電泳分析

取5μL擴增產物采用2.0%瓊脂糖凝膠(含DNA染料Genegreen)進行電泳1h后，置于伯樂凝膠成像儀(Gel Doc XR+)上成像。

2 結果與分析

本文選取了價格差異顯著的長鰭金槍魚和黃鰭金槍魚(金槍魚罐頭常用原料，前者價格顯著高于后者)作為研究對象，設計相應引物進行混合樣本的雙重特異性PCR，根據(jù)物種特異性擴增片段的Tm值及熔解曲線的差異對樣品中各組分進行定量分析。為評價所設計的引物的特異性，分別選取了經過形態(tài)學鑒定的11個長鰭金槍魚(Albacore)個體和20個黃鰭金槍魚(Yellowfin tuna)個體進行試驗，同時還使用了同屬的3個大目金槍魚(Bigeye tuna)個體作為對照。

2.1 引物設計

表1 熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers for real-time PCR assays

注：a表示引物序列中加粗字體表示引物和黃鰭金槍魚之間的錯配堿基；下劃線標注的字體為引物和大目金槍魚間的錯配堿基；斜體表示引物和長鰭金槍魚之間的錯配。b表示引物與長鰭金槍魚(GU256526.1, AB101291.1)、黃鰭金槍魚(GU256528.1)和大目金槍魚(NC014059.1)的結合位點。

a： Bold letters indicate mismatches between primer and yellowfin DNA; Underlined letters indicate mismatches between primer and Bigeye DNA; Italic letters indicate mismatches between primer and Albacore DNA.b： Locations are in reference to Albacore (GU256526.1, AB101291.1); Yellowfin tuna (GU256528.1); Bigeye tuna (NC014059.1).

2.2 引物特異性評價及擴增產物Tm值確定

選取來自長鰭金槍魚、黃鰭金槍魚和大目金槍魚3種模板，在相同的反應條件下對3組引物A246-F/A246-R(A)、Y303/338-F/Y338-R (Y1)和Y303/338-F/Y303R (Y2)的特異性進行評估。如果條件適當，引物組A只對長鰭金槍魚擴增陽性，引物組Y1和Y2只對黃鰭金槍魚擴增陽性。選取55、58和62℃ 3個退火溫度分別進行PCR反應(35個循環(huán))。PCR的結果表明55℃退火時，大目金槍魚在30個循環(huán)時已經出現(xiàn)大量的陽性擴增產物(數(shù)據(jù)未給出)；退火溫度為62℃時，擴增應為陽性的少數(shù)個體擴增失敗(數(shù)據(jù)未給出)。退火溫度為58℃時，3對引物(A、Y1、Y2)都獲得了理想的區(qū)分結果，從而選取58℃為合適的PCR退火條件。

表2 單重熒光定量PCR的Ct值和Tm值統(tǒng)計結果Table 2 The statistics of Ct and Tm values of three groups of simplex-PCR annealing at 58℃

表2列出了退火溫度為58℃時，3組引物的單重熒光定量PCR的Ct值和Tm值(見表2)。結果顯示：引物組A檢測3種單一模板，循環(huán)數(shù)大于28.59時，能將11個陽性樣本(長鰭金槍魚)全部檢出；循環(huán)數(shù)小于31.54時，23個陰性樣本DNA不會被擴增。同樣，引物組Y1和Y2的PCR循環(huán)數(shù)在28.73～31.32和29.57～33.09時均不會出現(xiàn)陽性個體和陰性個體誤檢的情況。對于不同的個體，Ct值變化較大，可能是由于模板含量波動造成，這里采用同種魚不同個體Ct值的平均值作為設定循環(huán)數(shù)的參考，即將雙重PCR的循環(huán)數(shù)設為30，達到區(qū)分幾種魚的目的。

綜合以上分析，最終確定雙重PCR的反應條件為：50℃ UDG處理2min；95℃ 2min；98℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s, 78℃ 10s讀取熒光，30個循環(huán)。

為達到對混合樣品定量檢測的目的，一般要求Tm值相差1℃以上，同時Tm值測量誤差越小越好。因此，對擴增片段的Tm值及其波動范圍的確定是十分必要的。本文對3種金槍魚的多個個體進行單重PCR并測定了產物的Tm值(見表2)。測定結果顯示來自長鰭金槍魚的246 bp片段(A)Tm值為81.4～81.5℃；黃鰭金槍魚的338 bp片段(Y1)和303 bp(Y2)的Tm值分別為83.2～83.5℃和82.8～83.1℃。3種片段各自的Tm值的測量誤差在0.3℃以內。A(246 bp)和Y1(338 bp)2種片段Tm值相差(1.9±0.1)℃，A (246 bp)和Y2 (303 bp)2種片段Tm值相差(1.5±0.1)℃；理論上，熔解曲線峰(即A-Y1組合或A-Y2組合)均能夠分開。因此，使用2組引物(A-Y1或A-Y2)雙重PCR體系的擴增產物能夠通過熔點測定進行區(qū)分。

從Y1和Y2的單重PCR結果(表2中Ct值)看，2對引物的特異性都很好，都不會擴增非目標魚種(長鰭和大目金槍魚)。Y1擴增產物與A擴增片段的Tm差異大于Y2擴增產物與A擴增片段之間的差異，由此判斷由A-Y1引物組合建立的dPCR-Tm體系應優(yōu)于用A-Y2建立的dPCR-Tm體系。

2.3 dPCR-Tm檢測混合樣品

為研究dPCR-Tm是否具有對長鰭和黃鰭金槍魚的混合物組分進行定量分析的能力，制備了由兩種金槍魚(質量比不同)組成的混合樣品。各混合樣本中長鰭和黃鰭金槍魚的質量比依次為： 19/1、7/1、4/1、3/1、2/1、3/2、1/1、2/3、1/2、1/3、1/4、1/5.5、1/9、其中長鰭金槍魚的含量為： 95%，87.5%， 80%，75%，66.7%，60%，50%， 40%， 33.3%， 25%，20%，15.4%和10%。

首先選取上述擴增產物Tm值相差較大和引物特異性好的A-Y1 (A246-F、A246-R、Y303/338-F、Y338-R) 引物組合建立的雙重PCR體系進行混合樣本的檢測。結果顯示(見圖1)，當長鰭金槍魚含量高于25%時，能夠檢測到2個熔解曲線峰，分別為A峰(81.4～81.5℃，左)和Y1峰(83.2～83.5℃，右)(見圖1a)。但不幸的是不論2種金槍魚比重孰多孰少，Y峰峰值都高于A峰峰值，即A-Y1建立的dPCR-Tm體系并不適合對混合樣品進行量化分析。

(a圖使用A-Y1引物，b圖使用A-Y2引物。縱坐標為熒光值對溫度的一次微分值。a: Using A-Y1 combination as primers. b： Using A-Y2 combination as primers. The vertical coordinate is the value of first order differentiation.)

圖1 混合樣品的PCR產物熔解曲線分析
Fig.1 Anlysis of melting curves of PCR products from mixtures

為找出雙重PCR結果異常的原因，作者用A-Y1引物組擴增單一模板(長鰭金槍魚或黃鰭金槍魚)發(fā)現(xiàn)：當只存在長鰭金槍魚模板(120或12 pmol/L)時，仍然檢測到2條DNA條帶，分別為246 和338 bp(見圖2)；當只存在黃鰭金槍魚模板(120或12 pmol/L)時，只檢測到一條338 bp的條帶。分析原因，發(fā)現(xiàn)這是由于該體系中有一條引物(Y338-R)與2種DNA(長鰭和黃鰭)均完全匹配，導致引物Y338-R和A246-F同長鰭金槍魚模板完全互補而得到了338 bp的產物(見表1)。這表明建立雙重PCR方法，設計引物應保證雙重PCR體系中的每條引物對非目的模板都有一定的區(qū)分能力，各對引物的擴增互不干擾。

(L:100 bp DNA Ladder)圖2 2對引物對單一模板的擴增結果

本文進一步對A-Y2(A246-F、A246-R、Y303/338-F、Y303-R)引物組合建立的雙重PCR體系進行了評估(圖2右側)。結果顯示：A-Y2引物組合擴增單一模板時，分別只有一種擴增產物，即246 bp(長鰭金槍魚)或303 bp(黃鰭金槍魚)。這表明引物互不干擾，可以使用A-Y2組合，研究dPCR-Tm方法對混合樣品定量檢測的可行性。

選用A-Y2組合建立的dPCR-Tm體系檢測混合樣品的結果如圖1b所示(另參見附圖1)。當含有5%及以上長鰭金槍魚時，該體系能夠檢測到A峰(對應溫度81.5℃)即長鰭金槍魚的存在；當含有10%及以上黃鰭金槍魚時，該體系也能夠檢測到Y峰(對應溫度82.8～83.1℃)。將Y峰和A峰的峰值比對2種魚魚肉的含量比作圖發(fā)現(xiàn)，峰高比值與混合物中黃鰭金槍魚(Y)和長鰭金槍魚(A)含量比呈線性關系(見圖3)。當黃鰭金槍魚含量多于長鰭金槍魚時，峰值比和含量比的線性擬合相關系數(shù)：R2=0.96，線性關系良好(見圖3a)。當長鰭金槍魚含量多于黃鰭金槍魚時，峰值比和含量比的線性擬合相關系數(shù)：R2=0.99，線性關系良好(見圖3b)。由此說明A-Y2引物組合建立的dPCR-Tm體系可以定量分析各組分的含量。

為了進一步評估A-Y2引物組合建立的dPCR-Tm體系定量分析2種金槍魚混合物的準確性，本研究制備了8個混合樣品并使用A-Y2體系進行了檢測分析。將分析得到的熔解曲線峰值比代入圖3a 或圖3b所示的關系式中，計算混合物中長鰭金槍魚或黃鰭金槍魚的含量。dPCR-Tm測定的金槍魚含量與實際含量比較結果(見表3)表明：該dPCR-Tm體系定量分析混合樣品含量的誤差在5% 以下。

綜上，長鰭金槍魚的含量在10%～95%的范圍內，都可以進行定量檢測，誤差一般可控制在5%以下。而一般定量PCR的方法分析混合樣品時，需要分別進行擴增和定量分析，誤差較大而且難以控制?？梢哉J為，本文所建立的dPCR-Tm方法具有很強的對近緣物種混合物進行量化分析的能力。

(a 圖為長鰭金槍魚含量少于50%，b圖為長鰭金槍魚含量多于50%。a: The content of Albacore was less than 50 percent. b: The content of Albacore was more than 50 percent.)

圖3 長鰭和黃鰭金槍魚含量比隨對應熔解曲線峰值比的變化

Fig.3 The ratio of content between Albacore and Yellowfin tuna along with the ratio of corresponding peak value

表3 A-Y2引物組合建立的dPCR-Tm體系檢測混合樣品中長鰭金槍魚含量的誤差分析結果Table 3 Error analysis results of detection of Albacore content in mixture using A-Y2 dPCR-Tm assays

Note:①Ratio of peak value Y/A=0.99×Content ratio Y/A；②Ratio of peak value A/Y=1.12×Content ratio A/Y；③Ratio of peak value；④Measured content；⑤Actual content；⑥Relative error

3 討論

本研究將雙重PCR和熔解曲線測定法結合，利用引物的高特異性和擴增片段熔點的差異以及各產物量的比值對熔解曲線的影響，建立了能夠對近緣物種混合物組分進行定量分析的方法。以長鰭金槍魚和黃鰭金槍魚的混合樣品的檢測為例，此方法能夠檢測到5%的長鰭金槍魚和10%的黃鰭金槍魚，并能進行較準確地定量分析。在一定的緩沖溶液中，較短DNA的Tm值受GC含量、雙鏈長度和DNA 濃度的影響[17]。而對于長鏈DNA，因其變性過程中往往產生局部熔解，GC含量低的部分先解鏈，一般認為熔解單元的長度為40～100 bp[18]。長度大于100 bp時DNA的Tm值一般只受GC含量和溶液條件的影響。另外，種內變異帶來的幾個堿基的變化對Tm值的影響也很小(同一物種的不同個體之間的PCR產物的Tm測定誤差在0.3℃以內)。因此本文建立的方法只需判斷特異性引物處的種內保守程度，不必考慮片段內序列的變異。這也是本方法優(yōu)于PCR-RFLF、PCR-SSCP和探針法之處[6-8]。

與分別進行單重定量PCR，通過比較Ct值的定量方法相比，本方法同時擴增2種模板，直接根據(jù)熔解曲線一次微分的峰值比得到各種組分的含量，大大減少了操作不當帶來的誤差。另外，常規(guī)定量PCR方法需要分別對標準樣品進行絕對定量，對模板質量要求很高。而本方法只要將2種原料樣品(不是提取后的DNA)按不同比例混合，然后提取DNA進行PCR，做出標準曲線，即可準確測定未知含量的混合樣品。雖然已有研究人員利用多重PCR和熔點測定法對病原菌檢測[10-12]，但這些研究只是針對不同科甚至不同目的病原菌(非近緣物種)的混合樣品進行的定性檢測。

建立此方法需要設計高特異性的引物，要求能夠將目標物種與其他物種分開，即陽性擴增和陰性擴增物種的Ct值(單重PCR)差異足夠大。如本文設計的3組引物(A、Y1和Y2)擴增不同物種的Ct值相差9左右，區(qū)分相似模板的能力很強；但需要注意的是，不能簡單通過單重PCR評估引物的特異性，還要考察雙重PCR的引物體系對單一模板的擴增情況，必須保證2個擴增互不影響，這是此方法對混合樣品準確定量的前提。如：本文中使用的A-Y1組合，雖然A引物組和Y1引物組能很好地區(qū)分2種模板，但A引物組和Y1引物組共同存在時，使用長鰭金槍魚模板能擴增2種片段(見圖2)，不適合做雙重PCR。只有正反向引物都有足夠區(qū)分模板能力時才能保證雙重PCR順利進行。A-Y2組合的Y303-R引物在3(末端引進一個針對長鰭金槍魚模板的A/T錯配(同黃鰭金槍魚模板完全互補)，只能擴增黃鰭金槍魚模板，實現(xiàn)了雙重PCR擴增。

本文針對長鰭金槍魚和黃鰭金槍魚混合樣品建立的dPCR-Tm體系能夠檢測出10%的金槍魚，此檢測限低于FDA中對于混合金槍魚罐頭中對長鰭金槍魚的含量要求(20%)。不同金槍魚罐頭(混合比不同)，價格差異顯著。FDA中規(guī)定標簽為白金槍魚的產品中只能含有長鰭金槍魚，而本文建立的方法至少可以檢測到5%的黃鰭金槍魚，可以用于白金槍魚產品的質量檢測。

總之，本文建立的dPCR-Tm方法能夠快速、簡便、準確地對混合樣品中的物種組成進行定量分析，解決了混合樣品中各物種難以準確定量的難題?？梢酝茢啵痉椒ㄔ谑称钒踩?，含多種耐藥基因的菌株篩選，以及基因診斷等領域有廣泛的應用前景。

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責任編輯 朱寶象

A Novel Method of Identifying Close-Related Species in Mixed Species

JIA Xiu-Shuang, WANG Jing, LIANG Xing-Guo

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A novel quantitative analysis method for measuring the content of two close-related species in their mixture were developed based on the combination of duplex PCR (dPCR) and melting temperature (Tm) measurement of PCR products. At first, primers were designed to carry out dPCR to amplify simultaneously one DNA fragment from one species and another fragment from the other species. The two PCR products were designed to have enough difference inTm(>1℃). Then dPCR was carried out, and theTms of PCR products were measured by recoding the fluorescence change with temperature, which is caused by different intensity of fluorescence between dsDNA and ssDNA in the presence of a dsDNA-binding dye. There should be two peaks on the plot of first differential of fluorescence value to temperature atTms of each PCR product, and the quantitative analysis of relative content can be carried out according to the ratio between the heights of two peaks. Here, mixtures of albacore and yellowfin tuna were taken as an example to assess the feasibility and efficiency of this method. The results showed that there is a good linearity between the content ratio and peak height ratio. The method can accurately quantify the content of each species, e.g. more than 10% of albacore or more than 5% of yellowfin tuna, indicating that this approach is practical. This novel method can solve the problem of quantitative analysis of mixed species and have a wide range of applications in food safety, genetic diagnosis and so on.

duplex PCR; melting temperature; mixed species; quantitative analysis; species identification

山東省自然科學杰出青年基金項目(JQ201204)；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目(IRT1188)資助

2014-03-11;

2014-05-08

賈秀雙(1988-)，女，碩士生，研究方向：海洋資源微生物及生物工程。E-mail: xiushuangjia@163.com

** 通訊作者： E-mail: liangxg@ouc.edu.cn

TS201.6

A

1672-5174(2015)04-046-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140083