杜晉平　賈陳忠　薛翼鵬　張文杰　李宏全

摘要：以黃芪多糖粗提物為樣品，采用蒽酮-濃硫酸比色法測定其多糖含量，并利用聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱進(jìn)行純化，采用不同洗脫劑洗脫；用氯磺酸-吡啶法對黃芪多糖進(jìn)行硫酸酯化；紅外光譜分析黃芪多糖粗提物、純化樣及硫酸酯樣品，研究黃芪多糖粗提物的純化和硫酸化并對其紅外光譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，聚酰胺柱或AB-8大孔樹脂柱對黃芪多糖進(jìn)行純化，使用去離子水或30%以下的乙醇作為洗脫劑均可取得較好的效果；氯磺酸-吡啶法可以對黃芪多糖進(jìn)行硫酸酯化。

關(guān)鍵詞：黃芪多糖；柱純化；硫酸酯化修飾；紅外光譜

中圖分類號：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0154-05

藥用黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus mongholicus Bunge）或膜莢黃芪（A.membranceus Bunge）的干燥根，其味甘，性微涼，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利尿脫毒等功效[1]。黃芪多糖（Astragalus polysacharides，APS）是黃芪中重要的天然有效成分，是黃芪藥理作用中起決定性因素的一類大分子化合物，具有促進(jìn)抗體生成、抗菌、抗病毒、防衰老及調(diào)節(jié)血糖等作用[2]，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床及動物免疫增效劑[3]，對黃芪多糖的研究引起了人們極大的關(guān)注。

黃芪中所含化學(xué)成分較多，包括多糖、甙類、氨基酸、黃酮和微量元素等[4]。不同來源的黃芪原料（即使是相同黃芪原料），提取和分離過程的差異都可能造成產(chǎn)物的不同。為了有效探討黃芪中多糖的作用效果，需要純度較高的黃芪多糖來進(jìn)行研究，前人對黃芪多糖的提取和純化工藝進(jìn)行了諸多研究[5，6]。

研究表明，一些天然多糖經(jīng)過硫酸酯化得到了用途更為廣泛的多糖衍生物[7]。多糖經(jīng)過硫酸酯化修飾后，除了能獲得抗病毒活性外，還可產(chǎn)生其他生物學(xué)活性[8]。利用硫酸酯化這種修飾方式來增加多糖的生理活性已經(jīng)成為當(dāng)前開發(fā)藥品和保健功能食品的重要手段之一[9]。本試驗(yàn)利用紅外光譜法對黃芪多糖硫酸酯化前后的光譜圖進(jìn)行比較，以期通過多糖硫酸酯鍵的特征吸收峰，得到多糖硫酸酯化的位置，為硫酸酯化修飾的黃芪多糖結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系提供依據(jù)。在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，對黃芪多糖粗提品進(jìn)行不同純化方法的比較，為黃芪多糖功能的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪提取物，購自陜西永源生物技術(shù)有限公司，由豆科植物蒙古黃芪的干燥根提取，編號YYS-015，規(guī)格為黃芪多糖≥50%，棕黃色細(xì)粉末。

1.2 主要試劑

葡萄糖（AR）、葡聚糖（AR）、無水乙醇（AR）、蒽酮（CP）、濃硫酸（CP）、鋁粉、碳酸氫鈉（AR）、聚酰胺樹脂和AB-8大孔樹脂（勁凱樹脂有限公司，武漢）。

1.3 主要儀器

紫外分光光度計（UV755B型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）、控溫攪拌水浴鍋（DK-8D型，金壇市醫(yī)療儀器廠）、冷凍干燥器（LGJ型，武漢玉立奧博科技發(fā)展有限公司）、紅外光譜儀（NicolET 6700型，賽默飛世爾科技公司）、透析袋（45-1000型，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）等。

1.4 測定方法

1.4.1 黃芪多糖粗提樣品中多糖含量的測定

1）對照溶液配制：精確稱取葡萄糖和葡聚糖各10 mg，用去離子水溶解定容至100 mL，其濃度為0.1 mg/mL。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和回歸方程計算：分別精確量取葡萄糖或葡聚糖對照溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按楊莉等[6]介紹的蒽酮-濃硫酸比色法操作，顯色60 min后，于625 nm處測吸光度值A(chǔ)，以A為縱坐標(biāo)，溶液中對照的量W（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行多項(xiàng)式預(yù)測回歸，得到葡萄糖回歸方程為A=28.63W2+6.434W，R2=0.991 9，葡聚糖回歸方程為A=23.08W2+2.812W，R2=0.997 1。

3）樣品中多糖含量的測定：精確稱取20～30 mg干燥（65 ℃）的多糖粗提樣品，加去離子水100 mL，過濾，收集濾液。取濾液0.5 mL，按上述的蒽酮-濃硫酸比色法操作顯色后，于625 nm處測定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品的多糖含量，或者由回歸方程計算樣品中黃芪多糖的含量。

1.4.2 黃芪多糖工藝的純化

1）聚酰胺樹脂柱（簡稱聚酰胺柱，下同）預(yù)處理。取聚酰胺以90%～95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3～4倍體積的90%～95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣（或極少殘渣）。再依次用2.0～2.5倍體積5%NaOH水溶液、1倍體積的去離子水、2.0～2.5倍體積的10%醋酸水溶液洗脫，最后用去離子水洗脫至pH中性，備用。

參照王淑萍等[2]的方法進(jìn)行工藝純化。稱取1.0 g黃芪多糖粗提樣品，用去離子水溶解，上處理好的聚酰胺柱（柱體積為100 mL），上柱流速2 mL/min，吸附12 h，分別用200 mL去離子水、10%、30%、50%和70%的乙醇洗脫，洗脫流速2 mL/min。洗脫液蒸干、稱重。洗脫物加水溶解分別定容在250 mL容量瓶中。分別吸取上述溶液0.2 mL于10 mL容量瓶，按“1.4.1”配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法處理樣品，在625 nm處測定吸光度值。

2）用AB-8大孔樹脂柱替換聚酰胺柱，其他操作一樣，進(jìn)行黃芪多糖純化工藝的研究。

1.4.3 黃芪多糖硫酸化及凍干粉制備 采用氯磺酸-吡啶法[7]。將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰水中，加入吡啶25 mL，攪拌使之充分冷卻。用滴液漏斗緩慢加入氯磺酸2.5 mL，約30 min滴加完畢，燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體（需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，小心氯磺酸加入后噴濺）。然后加入黃芪多糖粗提樣品0.4 g（65 ℃預(yù)干燥），迅速將三頸燒瓶移入沸水浴中，恒溫攪拌1 h左右，冷至室溫。將反應(yīng)液加入約3倍體積的無水乙醇靜置沉淀24 h以上，析出沉淀。沉淀溶于去離子水，裝入透析袋，自來水透析48 h，去離子水透析24 h，透析中每3 h左右換水1次。過濾，濾液凍干得到黃芪多糖硫酸酯（Astragalus polysacharin sulfate， APSS）。endprint

1.4.4 紅外光譜檢測 將黃芪多糖粗提樣、純化樣、硫酸酯樣凍干至無水的粉末狀態(tài)，在紅外光譜儀上利用反射法在4 000～4 00 cm-1范圍內(nèi)掃描測定紅外光譜。

1.5 統(tǒng)計分析

采用t-test對以葡萄糖和葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)的黃芪多糖含量進(jìn)行分析；采用LSD法對黃芪多糖的純化（過柱效果）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪粗提樣品中多糖含量測定結(jié)果

分別以葡萄糖和葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)時，粗提樣品中黃芪多糖的含量為葡萄糖（52.7±2.4）%、葡聚糖（50.3±3.8）%。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)測得的含量高于以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)的含量，但二者差異不顯著。

2.2 黃芪多糖純化結(jié)果

聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱對黃芪多糖的純化效果見表1和表2。由表1和表2可知，分別以葡萄糖和葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)時，利用聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱對黃芪多糖進(jìn)行純化，均以去離子水、10%乙醇或30%乙醇洗脫效果為好，三者間差異不顯著。50%乙醇和70%乙醇的洗脫效果低于前三者，且差異顯著，尤以70%乙醇洗脫效果最差。

2.3 紅外光譜檢測

黃芪多糖粗提物、多糖純化、多糖硫酸酯樣品的紅外光譜如圖1所示。由圖1可知，在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)，黃芪多糖的粗提物于3 301、2 893、1 605、1 362、1 024、843、676 cm-1處有明顯的吸收峰，為糖類化合物的一般吸收峰。過聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱的純化多糖吸收峰較為接近，除后者在709～688 cm-1附近有特征吸收峰外，其余各峰范圍基本一致（3 378～3 330 cm-1、1 635～1 621 cm-1、1 351～1 340 cm-1、1 023 cm-1）。黃芪多糖硫酸酯的紅外吸收光譜在4 000～1 641 cm-1及759～692 cm-1，與粗提物和純化樣品相似，但在1 249～1 150 cm-1和940 cm-1處出現(xiàn)了特有的吸收峰。

3 小結(jié)與討論

3.1 黃芪多糖含量測定

蒽酮比色法是目前常用的定糖方法。林炎坤[10]比較了蒽酮-稀硫酸外加熱法、蒽酮-濃硫酸外加熱法、蒽酮-硫酸水合熱法3種方法的定糖效果，指出稀硫酸法由于系統(tǒng)中硫酸比例較小，脫水反應(yīng)困難，需煮沸10 min才能達(dá)到顯色高峰，且測得糖值低，為濃硫酸法的78%～82%；蒽酮-硫酸水合熱法雖不需外加熱，但反應(yīng)系統(tǒng)中水和硫酸的比例很關(guān)鍵，且該法不適合對阿拉伯糖的測定，另外木糖、核糖等戊糖可能也不適于該方法；蒽酮-濃硫酸法反應(yīng)體系中硫酸比例高，脫水作用強(qiáng)烈，加入蒽酮后沸水浴2～3 min可充分顯色，在沸水浴10～15 min效果均較好，顯色后30 min到3 h間吸光度值都很穩(wěn)定。因此本研究中，參照楊莉等[6]的方法，加入蒽酮-濃硫酸后沸水浴2 min，然后混勻靜置60 min開始比色。

比色測定時選擇最大吸收所在波長為測定波長。楊莉等[6]測定黃芪多糖含量時，采用苯酚-濃硫酸法選擇490 nm波長，而采用蒽酮-濃硫酸法選擇625 nm波長；王淑萍等[2]用苯酚-濃硫酸法測定黃芪多糖含量，采用490 nm波長；王黎明等[11]用蒽酮-濃硫酸法選擇675 nm波長測定茶多糖含量；黃皓等[12]用蒽酮-硫酸法測定魔芋葡甘寡糖時最大吸收波長為620 nm。本試驗(yàn)中，通過400～800 nm范圍內(nèi)掃描，測得的最大吸收波長為625 nm。在蒽酮-濃硫酸作用下，葡聚糖與葡萄糖發(fā)生相同的顏色反應(yīng)。因此，在測定多糖含量時以葡萄糖或葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)參照物有相同的效果。

3.2 黃芪多糖純化

劉星堦等[13]采用粗多糖乙醇沉淀，然后過Sephadex G-50柱，最后透析的方法得到純化多糖；吳麗等[14]將黃芪多糖脫蛋白沉淀物過DEAE-纖維素層析，然后透析，得到黃芪多糖；朱曉霞等[15]綜述了多糖純化的方法，這些研究從不同方面介紹了黃芪多糖純化的方法和優(yōu)缺點(diǎn)，對后來研究提供了參考。

聚酰胺和AB-8大孔樹脂對黃芪多糖均有比較好的純化效果[2]。聚酰胺是化學(xué)吸附原理的氫鍵吸附，而大孔樹脂是物理吸附。對于樣品的細(xì)分或純化，較多采用聚酰胺柱，粗粉一般用大孔樹脂進(jìn)行分段，二者的選擇要根據(jù)所純化的組分性質(zhì)來定。本試驗(yàn)中采取聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱，同時以去離子水和乙醇進(jìn)行洗脫，得到了黃芪多糖純化的較適宜條件，特別是以去離子水作為洗脫劑，多糖的純度可達(dá)90.8%。

吳麗等[14]的研究中，黃芪多糖先經(jīng)脫除蛋白，然后再過柱純化。本試驗(yàn)所用黃芪多糖是由生產(chǎn)廠家提供的粗提品，經(jīng)測定粗蛋白含量較低，且多糖含量較高（CP<0.2%，APS>50%），因此沒有進(jìn)行粗蛋白去除。

3.3 黃芪多糖硫酸化

多糖的化學(xué)修飾方法很多，如硫酸化、烷基化、乙?；?、硒化、羧甲基化、硬脂?；萚8]。利用糖殘基上的羧基、羥基、氨基等基團(tuán)，運(yùn)用化學(xué)方法進(jìn)行修飾，可能會提高多糖的活性，現(xiàn)已成為糖藥物化學(xué)研究的一個重要分支。通過化學(xué)方法對多糖分子進(jìn)行改性，使其具有更多的生物活性或者強(qiáng)化已有的生物活性，能夠更廣泛地應(yīng)用于臨床。

多糖硫酸化常用的方法有：濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-吡啶法。氯磺酸-吡啶法因產(chǎn)物回收方便、收率較高，被較多采用[8]。多糖經(jīng)硫酸酯化后，易與蛋白質(zhì)特定的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而改變其構(gòu)象，影響其生物活性和功能，使其具有明顯的抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病、增強(qiáng)免疫和抗凝血等活性[9]。本試驗(yàn)通過氯磺酸-吡啶法獲得了黃芪多糖硫酸酯，為后續(xù)的研究提供了材料。

3.4 紅外光譜測定

特征吸收峰物質(zhì)的紅外光譜是其分子結(jié)構(gòu)的反映，光譜圖中的吸收峰與分子中各基團(tuán)或鍵的振動形式相對應(yīng)。通過比較大量已知化合物的紅外光譜，從中總結(jié)出各種基團(tuán)或鍵的吸收規(guī)律。本試驗(yàn)中4種樣品3 378～3 301 cm-1間為氫鍵的伸縮振動吸收；2 893 cm-1雖理論上為氫鍵振動吸收，但結(jié)合前人的研究分析[16]，應(yīng)為次甲基的C-H伸縮振動，是糖類的特征吸收峰；1 641～1 340 cm-1間一般為C=O非對稱伸縮振動，其中對黃芪多糖來說，1 626 cm-1附近會有其多糖的水合振動吸收峰，這可作為黃芪多糖簡單的鑒別標(biāo)準(zhǔn)[17]；同時，與前人的研究[15]中黃芪多糖對照的紅外光譜（黃芪多糖的特征吸收峰為3 378、2 927、1 626、1 417、1 050 cm-1）比較分析，可知本試驗(yàn)中的紅外光譜與對照基本一致。endprint

根據(jù)朱玉婷等[9]的研究表明，1 261 cm-1左右的吸收是S=O伸縮振動，808 cm-1左右的吸收是C-O-S的拉伸振動；馮秀梅等[7]研究表明，黃芪多糖硫酸酯在1 254.5 cm-1和818.0 cm-1處有硫酸酯鍵的特征吸收。本試驗(yàn)的多糖硫酸酯化樣品的紅外光譜中可以看出，1 249 cm-1和940 cm-1處的吸收應(yīng)該是黃芪多糖上的羥基被硫酸基取代形成的多糖硫酸酯鍵振動所產(chǎn)生。說明本試驗(yàn)成功獲得了黃芪多糖硫酸酯。

除上述不同波數(shù)處的特征吸收外，紅外光譜也能為物質(zhì)成分分析提供有用的信息。將本試驗(yàn)的紅外光譜圖與系統(tǒng)自帶譜庫進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)粗提物、純化及硫酸酯化樣品中均含有葡萄糖、羥丙基-β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、異麥芽糖等糖類化合物，這為黃芪多糖的化學(xué)組成的分析提供了重要參考。

3.5 小結(jié)

本試驗(yàn)中采用蒽酮-濃硫酸比色法測定黃芪粗提物中多糖含量時，以葡萄糖或葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果二者沒有顯著差異；利用聚酰胺柱或AB-8大孔樹脂柱對黃芪多糖進(jìn)行純化，用去離子水或30%以下的乙醇作為洗脫劑均可取得較好的效果，50%以上乙醇洗脫則效果較差；紅外光譜分析顯示，氯磺酸-吡啶法可以對黃芪多糖進(jìn)行硫酸酯化，為深入研究黃芪中多糖的優(yōu)化提純和硫酸化位點(diǎn)提供了依據(jù)。

致謝：本試驗(yàn)得到長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院肖立新老師和化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院鄒華老師的幫助，在此表示感謝。

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