香麗萍，穆玉明

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 83001l)

·綜 述·

靶向超聲造影劑在干細(xì)胞移植中的研究進(jìn)展

香麗萍，穆玉明

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 83001l)

近年來(lái)，干細(xì)胞移植技術(shù)在心肌梗死的治療中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，靶向超聲微泡技術(shù)能夠有效增強(qiáng)心肌梗死區(qū)域局部血管的通透性、提高該區(qū)域內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)效率、增加梗死區(qū)新生血管的形成，從而促進(jìn)干細(xì)胞靶向歸巢、改善心功能，提高干細(xì)胞移植的成功率。因此，本文通過(guò)整理總結(jié)相關(guān)資料，對(duì)將超聲聯(lián)合微泡技術(shù)應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死過(guò)程中的研究進(jìn)展做一綜述。

超聲微泡；干細(xì)胞移植；急性心肌梗死；靶向性

目前，諸多國(guó)內(nèi)外學(xué)者均對(duì)干細(xì)胞移植技術(shù)進(jìn)行了研究，干細(xì)胞移植技術(shù)能夠把供體干細(xì)胞移植到損傷的心肌組織中，修復(fù)損傷壞死的心肌細(xì)胞，同時(shí)還能在局部積聚誘導(dǎo)血管新生。該技術(shù)為急性心肌梗死的有效治療指明了一個(gè)嶄新的方向[1]，但其效果會(huì)受到移植干細(xì)胞存活率、分化率以及靶向性等限制[2]。有研究表明，超聲造影劑中微氣泡可加強(qiáng)空化效應(yīng)，從而促進(jìn)超聲生物效應(yīng)，利用超聲微介導(dǎo)術(shù)能夠提高移植干細(xì)胞存活率、分化率以及促進(jìn)心肌梗死區(qū)域內(nèi)血管的新生，其主要機(jī)理在于超聲介導(dǎo)微泡空化效應(yīng)靶向傳輸。本文就靶向超聲造影劑的組成、理化特性、制備方式、靶向分子成像及聯(lián)合超聲微泡造影劑促進(jìn)干細(xì)胞移植的研究進(jìn)展綜述如下，為進(jìn)一步研究靶向超聲造影劑在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用方面提供了理論基礎(chǔ)，使其能夠在干細(xì)胞移植技術(shù)治療心肌梗死的過(guò)程中發(fā)揮更積極的作用。

1 靶向超聲微泡造影劑的組成、理化特性和制備方式

靶向超聲造影劑是在超聲造影劑的表面連接上特異性配體，使其能夠自動(dòng)和靶器官或靶組織上相應(yīng)的受體結(jié)合，并產(chǎn)生的特異性影像，在分子水平上直觀地反映出病變位置的變化。

1.1 靶向超聲造影劑的組成 超聲造影劑主要成分是微氣泡，一般直徑為2～10 um，由核心及外殼包膜構(gòu)成。其中，超聲造影劑微泡的核心可以是氟碳類的氣體，也可以是磷脂或者是氟烷類的液體；超聲造影劑微泡的外殼包膜則多為脂類、多聚體或者白蛋白。外殼包膜成分的區(qū)別造成超聲造影劑微泡的理化性質(zhì)也存在一定的差別[3]，主要有脂質(zhì)類外殼包膜和白蛋白及多聚體等構(gòu)成外殼包膜兩種，其中脂類化合物外殼包膜則較薄，僅有1～3 nm，因此脂質(zhì)類物質(zhì)制成的外殼包膜更容易進(jìn)行靶向修飾，制備的靶向超聲造影劑具有偶聯(lián)配體的生物學(xué)活性，更有利于靶向超聲微泡技術(shù)的應(yīng)用，在國(guó)內(nèi)被廣泛使用。

特異性的靶向超聲造影劑作為一種理想的基因或藥物遞送載體，具有連接配體和其相應(yīng)的靶向組織的能力。超聲靶向分子成像就是利用這種特性將造影劑聚集在靶器官或者靶組織，然后利用超聲顯影技術(shù)在分子水平上呈現(xiàn)出靶器官或者靶組織的病理變化，最后實(shí)現(xiàn)特異性增強(qiáng)靶向區(qū)域信號(hào)以加強(qiáng)局部治療的作用。同時(shí)，靶向超聲造影劑和靶向微泡造影技術(shù)，通過(guò)介導(dǎo)微泡內(nèi)的藥物或基因，可以定位到病灶部位細(xì)胞表達(dá)的特異性抗原或受體上，達(dá)到靶向性定位治療的效果。

1.2 靶向微泡超聲造影劑的制備方法 靶向超聲造影劑外殼包膜與其特異性配體的連接方法主要有兩種：①非吸附性非共價(jià)鍵結(jié)合的免疫化學(xué)固定方法，該方法利用生物素-親和素系統(tǒng)較強(qiáng)的親和力，將生物素配體與超聲造影膜的外殼包膜連接在一起，將其生物素化，卻不改變其生物活性和生理特性，應(yīng)用較為廣泛的有親血栓性靶向超聲造影劑等；②直接化學(xué)連接法，首先需要將這類小分子配體與外殼包膜的分子進(jìn)行結(jié)合(直接或間接結(jié)合)，之后通過(guò)使用普通造影劑的制作方法來(lái)獲得具有穩(wěn)定黏附配體的超聲造影劑。

2 UTMD改善干細(xì)胞微環(huán)境可能的原理

2.1 UTMD可以引起心肌梗死區(qū)的炎性反應(yīng) 最佳的心肌微環(huán)境可增加干細(xì)胞的分化、存活，但尚未明確，一般認(rèn)為適度的炎性反應(yīng)可促進(jìn)其干細(xì)胞歸巢。粘附分子及生長(zhǎng)因子的表達(dá)有利于干細(xì)胞的黏附、增殖及分化；反之，過(guò)于強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)不利于干細(xì)胞的存活。UTMD引起炎細(xì)胞聚集，IL-1等炎性因子的釋放，并且有利于干細(xì)胞向心肌內(nèi)移行；在血管內(nèi)皮受到損傷以后內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)增多，從而促使循環(huán)中的干細(xì)胞被黏附分子作用而更牢固的黏附在受損的血管內(nèi)皮上。Zhong等[4]觀察到UTMD處理組犬心肌組織VEGF、SDF-1、VCAM-1和lL-1b的表達(dá)比非治療犬明顯增高，表明UTMD可能通過(guò)改變?nèi)募∥h(huán)境促進(jìn)MSCs歸巢。隨后的病理學(xué)結(jié)果表明，在1 MHz的頻率和1.0 W/cm2的強(qiáng)度下，UTMD能引起炎癥反應(yīng)，且僅有輕度心肌損傷。

2.2 UTMD可以改善局部微循環(huán) 心肌梗死后心臟重建尚包括新生血管和重建血運(yùn)系統(tǒng)。在自然愈合的損傷區(qū)域，由循環(huán)骨髓衍生細(xì)胞生成的血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)法再生出足夠的微血管網(wǎng)絡(luò)。因此提高局部血管生長(zhǎng)因子濃度，促進(jìn)治療性血管新生，恢復(fù)梗死區(qū)血供，是干細(xì)胞移植后能否存活的關(guān)鍵問(wèn)題。血管生長(zhǎng)因子包括VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、HGF等。一定能量的超聲波輻照微泡后產(chǎn)生的輻射壓力可使移植的干細(xì)胞推向血管壁，并使之在局部積聚。聲致孔隙效應(yīng)通過(guò)增寬毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，增加細(xì)胞膜的通透性，使外源性大分子進(jìn)入組織間隙或細(xì)胞中來(lái)提高基因轉(zhuǎn)染效率及干細(xì)胞移植率，導(dǎo)致局部組織微血管破裂，提高內(nèi)源性血管生長(zhǎng)因子分泌量，從而改善局部微循環(huán)。

3 超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)干細(xì)胞移植在心肌梗死區(qū)的歸巢

3.1 超聲聯(lián)合微泡提高局部血管通透性 超聲波的生物學(xué)效應(yīng)[5]是具有熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)等。增強(qiáng)空化效應(yīng)[6]是指通過(guò)外源性給予超聲微泡來(lái)增加空化核的數(shù)目、降低超聲的空化閾值來(lái)實(shí)現(xiàn)的?！翱栈恕笔侵敢后w中存在的微小氣泡?？栈?yīng)是指產(chǎn)生高溫、高壓、沖擊波來(lái)增寬內(nèi)皮細(xì)胞間隙、提高細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞膜發(fā)生短暫性可逆的小孔，增加微泡破裂周圍組織生物屏障的通透性。通過(guò)相關(guān)分析，徐琢等[7]利用干細(xì)胞移植來(lái)進(jìn)行豬急性心肌梗死的治療試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，利用超聲來(lái)對(duì)微泡的破壞進(jìn)行傳導(dǎo)可以明顯的提高干細(xì)胞在心肌梗死區(qū)的靶向移植效率，提示超聲破壞微泡產(chǎn)生機(jī)械作用和空化效應(yīng)，使內(nèi)皮細(xì)胞收縮，內(nèi)皮間隙增寬，同時(shí)促使干細(xì)胞向梗死的心肌組織細(xì)胞進(jìn)行遷移。此外，也有報(bào)道顯示，超聲介導(dǎo)微泡破壞對(duì)靶向血管的通透性有一定的影響，有利于干細(xì)胞的遷移，從而提高干細(xì)胞的移植效率。心臟功能的逐步完善也從另一方面證明了聲孔效應(yīng)的作用[8]。

3.2 超聲與微泡的刺激作用產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子，促進(jìn)干細(xì)胞歸巢 當(dāng)進(jìn)行干細(xì)胞移植時(shí)，首先需要將干細(xì)胞通過(guò)靜脈注射的方式注入體內(nèi)，然后要增加干細(xì)胞在心臟梗死區(qū)域和周邊組織的聚集數(shù)量，從而提高治療的成功率。干細(xì)胞歸巢過(guò)程中重要的相關(guān)因子是趨化因子、生長(zhǎng)因子及黏附分子等。趨化因子中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)及其受體(CXCR4)的SDF-l/CXCR4軸是促進(jìn)MSCs向損傷組織歸巢最重要的生物軸，組織損傷時(shí)局部受損組織SDF-l表達(dá)上調(diào)，使得表面表達(dá)CXCR4的MSCs向受損組織趨化歸巢[9]。而生長(zhǎng)因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及受體的HGF/c-met軸、干細(xì)胞因子(Stem cell factor，SCF)及受體的SCF/c-kit軸、粒細(xì)胞集落刺激因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血小板衍生因子(PDGF)等均與MSCs的歸巢相關(guān)。

Fujii等[10]通過(guò)超聲靶向微泡技術(shù)的使用來(lái)把VEGF和干細(xì)胞因子基因通過(guò)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入試驗(yàn)小鼠的梗死心肌細(xì)胞中，通過(guò)與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的血管密度、蛋白表達(dá)和祖細(xì)胞的歸巢方面都有明顯的提高，同時(shí)對(duì)心肌灌注和心室功能的完善具有明顯的改善作用。此外，F(xiàn)ujii在[11]后續(xù)的研究中通過(guò)超聲輻照攜干細(xì)胞因子與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α基因的微泡造影劑來(lái)治療心肌缺血的實(shí)驗(yàn)大鼠，在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，為了更顯著的研究治療效果特意增加了治療的過(guò)程并進(jìn)行多次治療，在治療的過(guò)程中對(duì)心肌的損害進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用這兩種技術(shù)進(jìn)行心肌缺血的治療過(guò)程中，對(duì)缺血心肌的血管密度有明顯的增加作用，從而進(jìn)一步減小了心肌梗死的范圍，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，重復(fù)治療的次數(shù)達(dá)到6次是實(shí)驗(yàn)大鼠的心肌血管密度達(dá)到最大，而心肌灌注功能與心室功能也隨著治療次數(shù)的增加而逐漸完善。

4 超聲結(jié)合微泡促進(jìn)梗死區(qū)心肌血管新生

在近些年關(guān)于超聲微泡和干細(xì)胞移植的研究中發(fā)現(xiàn)，這兩者對(duì)血管的新生有很好的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，由超聲微泡作用所引起的的梗死區(qū)血管新生其作用機(jī)理主要是通過(guò)炎癥反應(yīng)來(lái)促進(jìn)血管新生同時(shí)通過(guò)外源性基因的介導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)血管的新生[12]。梗死區(qū)血管新生需要多種因子對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)血管新生的因子是VEGF、bFGF、HGF、表皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-8、PDGF等[13]。Xu等[14]使用超聲輻照微泡造影劑來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞向試驗(yàn)兔缺血心肌組織的遷移，通過(guò)與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的心臟功能得以明顯的改善，心肌組織內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多，心肌纖維化的范圍明顯減小。Yuan等[15]通過(guò)向?qū)嶒?yàn)犬的心臟進(jìn)行HGF質(zhì)粒與微泡造影劑的注射并聯(lián)合超聲輻照來(lái)促進(jìn)基因的表達(dá)和血管的新生。Ghanem等[16]、Xu等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在超聲聯(lián)合微泡干預(yù)后VEGF表達(dá)都升高。除VEGF外，有多項(xiàng)研究也成功的應(yīng)用超聲造影劑這種新型的基因轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)載bFGF[17]、HGF[18]及HIF-1α[19]等基因，然后將此類基因轉(zhuǎn)移到受損的心肌組織中，從而提高干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，以促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生，從而改善心肌缺血的情況。

5 目前存在的問(wèn)題及展望

隨著超聲靶向破壞微泡技術(shù)在提高干細(xì)胞移植中的靶向歸巢、促進(jìn)心功能改善和聯(lián)合基因中的應(yīng)用不斷發(fā)展與進(jìn)步，同時(shí)也向我們提出了一些問(wèn)題：(1)超聲輻照介導(dǎo)的微泡破壞可能引起一些不良反應(yīng)，如血管內(nèi)溶血、組織出血及器官損傷等，這些都與超聲的機(jī)械參數(shù)密切相關(guān)。(2)超聲介導(dǎo)微泡的靶向破壞雖然可以提高干細(xì)胞治療心肌梗死的移植率，但是在這一治療過(guò)程中，超聲參數(shù)的選擇和使用目前還沒(méi)有相對(duì)統(tǒng)一的結(jié)論。Vancraeynest等[20]在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，如果使用的超聲參數(shù)過(guò)高會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物的左心室出現(xiàn)功能障礙，同時(shí)有短暫的ST段抬高從而導(dǎo)致心肌收縮帶的壞死。因此，微泡介導(dǎo)的相關(guān)超聲參數(shù)需要被大量、重復(fù)、系統(tǒng)地研究，以求將不良反應(yīng)降到最低而治療效果最佳。(3)超聲介導(dǎo)微泡破壞的時(shí)間窗：在急性的心肌梗死發(fā)生時(shí)，機(jī)體早期的炎癥反應(yīng)可以促使干細(xì)胞向梗死心肌組織遷移，但是有最佳的時(shí)間段，而目前的很多研究都沒(méi)有在這一研究中達(dá)到統(tǒng)一[21]。隨著新型超聲微泡的不斷發(fā)展，目前面臨的挑戰(zhàn)主要有：(1)通過(guò)對(duì)干細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行分析來(lái)構(gòu)建專一性的靶向超聲微泡，從而在活體內(nèi)更好的追蹤干細(xì)胞，對(duì)于急性心肌梗死發(fā)生后的干細(xì)胞作用機(jī)制進(jìn)行研究。(2)為了更好的提高干細(xì)胞移植的治療效果，構(gòu)建出活體內(nèi)大容量的特異性微泡。我們有理由相信，在醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展中，微泡的構(gòu)建技術(shù)與干細(xì)胞移植技術(shù)的不斷發(fā)展，多學(xué)科多領(lǐng)域的交叉融合和研究表明，靶向超聲微泡造影劑必將在干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的作用中發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)，擁有更加廣闊的發(fā)展前景。

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Research development of targeted ultrasound contrast agent in stem cell transplantation.

XIANG Li-ping,MU Yu-ming.
Department of Cardiac Ultrasonography,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA

In recent years,stem cell transplantation technology is more and more widely applied in the treatment of myocardial infarction.Experimental studies have found that,targeted ultrasound microbubble technology can effectively enhance local vascular permeability,improve efficiency of relevant cytokines expression and increase for-mation of new blood vessels in myocardial infarction areas,and thereby promote stem cell targeting homing,improve cardiac function and increase success rate of stem cell transplantation.Therefore,this article makes a review on the research progress of application of ultrasound combined with microbubble technology in the process of stem cells transplantation in treatment of acute myocardial infarction.

Ultrasound microbubble;Stem cell transplantation;Acute myocardial infarction;Targeting

R458

A

1003—6350（2015）06—0843—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0301

2014-10-09)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81271590）

穆玉明。E-mail：mym1234@126.com