姜紹全 （山東省海陽市畜牧獸醫(yī)站 265100）

王金亮 秦 燕 （山東省臨沂市動(dòng)物疫病控制中心）

禽痘病毒病主要發(fā)生于雞和火雞，鴿子偶有發(fā)病，鴨、鵝不易感。不同性別、年齡、品種的雞均易感染。本病一年四季均可發(fā)生，尤以秋季和冬季多發(fā)。病雞脫落的痘痂，為病毒散播的主要形式，皮膚或者粘膜上的傷口、蚊蟲叮咬亦可傳染該病，但不經(jīng)健康皮膚及口腔感染。雞群過于擁擠，雞舍通風(fēng)不良、陰暗潮濕，雞群打架、啄毛、交配等造成的外傷，雞群感染寄生蟲，營(yíng)養(yǎng)不良，維生素缺乏，飼養(yǎng)管理差等皆可導(dǎo)致該病的發(fā)生。若繼發(fā)其他感染可引起大批死亡，尤其對(duì)雛雞可造成極為嚴(yán)重的損失。2014年9月18號(hào)，海陽一蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)送檢一批12周齡疑似雞痘病毒感染的海蘭褐蛋雞。本實(shí)驗(yàn)室從流行病學(xué)、解剖學(xué)和實(shí)驗(yàn)室診斷出發(fā)對(duì)該病進(jìn)行了綜合診斷，并成功分離出雞痘病毒。

1 材料與方法

1.1 病料來源 海陽某養(yǎng)殖場(chǎng)的海蘭褐蛋雞群，于12周齡左右一些雞只開始出現(xiàn)消瘦，下痢，精神沉郁，縮頸，食欲減退，個(gè)別有呼吸道癥狀，每日發(fā)病數(shù)量呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)并伴有零星死亡。剖檢病雞可見肝臟出血，胰臟萎縮，脾臟表面有大小不等的壞死點(diǎn)，喉頭有黃色滲出物;腺胃腫大，腺胃乳頭出血，肌胃角質(zhì)層出現(xiàn)糜爛，肺臟出血。收集病變明顯的肝、脾、肺組織作為病原分離的病料。

1.2 材料與試劑 9～12日齡SPF雞胚購自山東省濟(jì)南市家禽研究所，健康成年蛋雞為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，未接種任何病毒?？股?注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素)購自山東魯抗醫(yī)藥有限公司；PmD18-T 載體試劑盒購自TaKaRa公司；感受態(tài)DH5ɑ細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 病料處理 無菌取病雞肝臟、脾臟、肺臟，加入4倍體積的生理鹽水震蕩充分，反復(fù)凍融3次，離心，取上清，加入終濃度為1萬IU的青、鏈霉素，4℃作用4h，待菌檢陰性，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒分離 將上述準(zhǔn)備材料接種于9日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜(CAm)，采用側(cè)面“開天窗”法，共接種15枚，每胚接種0.2ml；同時(shí)設(shè)置6枚接種等量生理鹽水作為對(duì)照。連續(xù)觀察一周，觀察胚的死亡情況及死亡雞胚絨毛尿囊膜變化，棄去24h以內(nèi)的死亡雞胚，收取死亡和未死雞胚的絨毛尿囊膜。將絨毛尿囊膜病料處理，繼續(xù)接種9日齡SPF雞胚，盲傳3代。

1.5 病毒的鑒定 病毒的PCR鑒定。（1）PCR引物設(shè)計(jì)：雞痘病毒引物根據(jù)GenBank已發(fā)表序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并由英濰捷基生物有限公司負(fù)責(zé)合成。引物序列如下：上游引物：ATACTTTACGATACA AACCT，下游引物：GTGCCTATGGAATCTGGT。（2）模板的制備：取第三代死亡雞胚的尿囊膜放于離心管中剪碎，每管加入8ul蛋白酶K 、500ul 10% SDS震蕩混勻，放入56℃水浴鍋中過夜。次日，將消化好的組織離心，取上清約400ul轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積苯酚、氯仿抽提，震蕩充分，12000r/min，離心10min，并重復(fù)此步驟一次。取上清約300ul加入2倍體積的無水乙醇混 勻，-20℃靜置30min，離心棄上清。以預(yù)冷的75%乙醇洗滌2次：12000r/min，離心15min，棄上清，沉淀通風(fēng)干燥，最后以50ul滅菌雙蒸水溶解。（3）PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為20ul，2×Es Taq mastermix 10ul，上、下游引物各1ul，模板2ul，雙蒸水6ul?；痉磻?yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃30s，54℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察擴(kuò)增片段的大小。

1.6 測(cè)序鑒定 按照DNA凝膠回收試劑盒的說明回收PCR產(chǎn)物，與PmD 18-T載體連接后，轉(zhuǎn)入DH5ɑ E.coli 感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆子進(jìn)行今夜PCR鑒定，將陽性克隆子送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序，并與GenBank中發(fā)表的相關(guān)序列進(jìn)行比較。

1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 按照病料處理方法處理第3代死亡雞胚絨毛尿囊膜，以上清液作雞冠劃痕，每組10只，同時(shí)以無菌生理鹽水以相同途徑對(duì)對(duì)照組作雞冠劃痕。接種后每天觀察接種雞的劃痕處變化及接種雞的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離 傳至第3代時(shí)雞胚死亡情況較為嚴(yán)重，死亡雞胚絨毛尿囊膜明顯增厚水腫，且尿囊膜上形成灰白色痘斑，而對(duì)照組雞胚均生長(zhǎng)良好。

2.2 病毒的鑒定 （1）PCR鑒定結(jié)果：利用合成的引物對(duì)第3代雞胚絨毛尿囊膜病毒進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳可見在約306bp處有一條帶，與預(yù)期一致(見圖1)。而H9型禽流感病毒，呼腸孤病毒等家禽常見疾病的檢測(cè)均為陰性。（2）測(cè)序結(jié)果：將擴(kuò)增引物回收、連接轉(zhuǎn)化、鑒定后測(cè)序，結(jié)果顯示，該序列與GenBank中發(fā)表的雞痘病毒p4b核心蛋白基因序列的同源性在90%以上。（3）動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)：將病毒上清對(duì)健康雞作雞冠劃痕，3～4d時(shí)，接種雞的接種部位陸續(xù)出現(xiàn)出現(xiàn)明顯的痘腫；而對(duì)照組雞冠劃痕處只有輕微結(jié)痂，無任何病變。

3 討論

圖1 PCR 鑒定電泳圖

禽痘是家禽及鳥類的一種接觸性傳染病，擴(kuò)散緩 慢。其特征是在羽毛稀少或無毛處有痘疹，或在口腔、咽喉等粘膜處形成纖維素性壞死性偽膜，易在大型雞場(chǎng)造成流行，致使病雞減食、消瘦，蛋雞產(chǎn)蛋下降。雞痘可分為皮膚型、粘膜型、混合型和敗血型。一旦感染禽痘病毒，養(yǎng)殖業(yè)將會(huì)蒙受巨大損失，且目前為止禽痘病毒病尚無特效藥物可以治療，故而對(duì)該疾病的預(yù)防十分重要。雞痘的預(yù)防除加強(qiáng)雞群的衛(wèi)生、管理等一般性措施外，較為可靠地方法是接種疫苗。接種雞痘疫苗后，應(yīng)于7～8d對(duì)接種雞群進(jìn)行抽查，檢查局部是否結(jié)痂或毛囊有無腫脹。若局部出現(xiàn)反應(yīng)則表示接種成功，否則應(yīng)予補(bǔ)種。本研究結(jié)合臨床癥狀、剖檢變化和實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)一起疑似雞痘病毒感染的病例進(jìn)行了確診并成功對(duì)雞痘病毒進(jìn)行了分離鑒定。首先對(duì)雞群的發(fā)病情況進(jìn)行大體了解：發(fā)病雞精神沉郁，食欲減退，消瘦，并伴有零星死亡。剖檢可見胰腺萎縮，腺胃水腫萎縮等癥狀。利用雞痘病毒特異性引物可擴(kuò)增出于預(yù)期基因片段大小一致的條帶，測(cè)序、動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果都表明此次病雞確為雞痘病毒感染所致。利用雞胚絨毛尿囊膜方法接種病毒，盲傳3代后收取死胚絨毛尿囊膜，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)可以確定此次成功分離出了雞痘病毒。