余潤蘭 ，劉亞楠 ，周 丹 ，彭堂見 ，劉學(xué)端 ，顧幗華 ，邱冠周 ，曾偉民

(1. 中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083； 2. 中南大學(xué) 生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410083)

隨著人類環(huán)境保護(hù)意識(shí)的加強(qiáng)，微生物冶金作為一種綠色工藝，備受關(guān)注。我國資源短缺，加上開發(fā)過度，形成了富礦少、貧礦多、礦石復(fù)雜資源難回收的局面。生物濕法冶金技術(shù)具有工藝成本低、污染小，能有效開發(fā)低品位、難處理礦產(chǎn)資源的特點(diǎn)，因而，成為當(dāng)今冶金領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1]。生物濕法冶金是指利用浸礦微生物(細(xì)菌、古菌和真菌)將礦石中的有價(jià)金屬離子溶解到浸出液中的過程，能夠有效地處理各種低品位礦石[2]。目前，生物濕法冶金技術(shù)主要應(yīng)用于黃鐵礦、黃銅礦、砷黃鐵礦等難處理硫化礦，浸礦微生物的研究主要集中在嗜酸氧化硫硫桿菌、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌、氧化亞鐵鉤端螺菌等硫化礦物浸礦 菌[3]。該技術(shù)具有較多顯著的優(yōu)點(diǎn)，如流程短、成本低、環(huán)境友好和污染低等。因此，生物濕法冶金已廣 泛應(yīng)用于國內(nèi)外各大礦山，如江西德興銅礦、福建紫金山礦業(yè)等。據(jù)報(bào)道，截止到21世紀(jì)初，全世界約21%的銅產(chǎn)量是由生物濕法冶金所得[4]。

微生物胞外多聚物(EPS)是生物冶金基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在微生物與礦物的吸附過程以及微生物對礦物氧化溶解過程中有重要的作用。但是，目前關(guān)于生物冶金領(lǐng)域EPS的研究仍然局限在對EPS提取方法探討和組成成分分析等方面，而對其中關(guān)鍵組分的作用及其機(jī)理研究較少，不利于EPS在生物冶金過程中作用機(jī)制的闡明，阻礙了生物冶金目前該方面的研究理論深層次的發(fā)展。

胞外多糖是EPS的重要組成成分，普遍存在于各種環(huán)境下形成的生物膜中，以雜多糖為主，且多屬聚陰離子性多糖，相對分子量一般為0.5×106~2×106，本文作者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中等嗜熱浸礦微生物浸出黃銅礦過程中胞外多糖主要有鼠李糖、海藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸(藻酸鹽的主要成分)[5](見表1)。RYDER等[6]認(rèn)為主要的胞外多糖包括藻酸鹽、生物膜胞外基質(zhì)多聚糖(Psl)和與菌膜和生物膜形成相關(guān)的胞外多糖(Pel)等。在菌株分泌EPS初期，藻酸鹽的含量較高，對菌株吸附到載體表面起重要作用。隨著EPS分泌量的增加和生物膜的形成，藻酸鹽和一些胞外蛋白類物質(zhì)共同組成生物膜的網(wǎng)狀骨架，維持生物膜的機(jī)械穩(wěn)定性[7]。另外，由于胞外多糖藻酸鹽中含有較多糖醛酸成分，易于吸附或結(jié)合環(huán)境中的Fe3+、Zn2+、Cd2+、Mn4+等金屬離子，從而為細(xì)胞提供微量元素，保證細(xì)胞的持續(xù)生長與功能活性。生物冶金過程中，SAN等[8]猜測礦物的溶解主要依賴于礦物表面富集的大量Fe3+，而這些Fe3+可能就是通過藻酸鹽中的糖醛酸成分結(jié)合而來。

綜上所述，藻酸鹽是胞外多聚物中重要組分之一。不僅在構(gòu)成生物膜骨架，維持生物膜結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用，而且藻酸鹽中的糖醛酸能夠吸附金屬離子，其研究能夠促進(jìn)胞外多聚物的深入研究，進(jìn)一步促進(jìn)浸礦機(jī)理的說明。

1 藻酸鹽的合成途徑及作用機(jī)制

1.1 藻酸鹽的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)

藻酸鹽是一類物質(zhì)的總稱，可以分為細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌藻酸鹽和藻類產(chǎn)生的海藻酸鹽。GORIN等[9]于1966年報(bào)道了從土壤中分離的棕色固氮菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌藻酸鹽，同年，LINKER等[10]從自然生境中分離得到多株能夠產(chǎn)生細(xì)菌藻酸鹽的銅綠假單胞菌菌株。1992年，BRUUS等[11]認(rèn)為細(xì)菌藻酸鹽有利于活性污泥絮體的形成，而林躍梅[12]對好氧顆粒污泥中的細(xì)菌藻酸鹽進(jìn)行提取、鑒定和深入研究，確定好氧顆粒污泥的多糖骨架，揭示顆粒污泥形成的必要條件。而在生物冶金領(lǐng)域，關(guān)于細(xì)菌藻酸鹽在胞外多聚物中所發(fā)揮作用的報(bào)道甚少。

細(xì)菌藻酸鹽和海藻酸鹽具有相同的基本結(jié)構(gòu)，是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)為單體隨機(jī)聚合形成的線性高分子聚合物，其一級(jí)結(jié)構(gòu)受不同來源決定。其基石結(jié)構(gòu)有3種：1) 完全由β-D-甘露糖醛酸按照β-(1→4)鍵結(jié)合的M-M型；2) 完全由α-L-古洛糖醛酸按α-(1→4)鍵結(jié)合的G-G型；3) 由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸混合交替結(jié)合的G-M型，如圖1所示。細(xì)菌藻酸鹽是一種乙酰化的線性多糖，在C2C3羥基上被不同程度地乙?；?，乙酰化的程度隨著菌株和生長條件的不同而改變。藻酸鹽及生物膜的激光共聚焦掃描電鏡圖[13]如圖2所示，其中，SYTO 9是一種綠色熒光染料，能夠?qū)Ω锾m氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色，最大激發(fā)光波長488 nm，最大散射光波長522 nm。標(biāo)記熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)最大吸收光譜550 nm，最大發(fā)射光譜為600~620 nm，能與蛋白質(zhì)結(jié)合。

表1 中等嗜熱浸礦微生物浸出黃銅礦過程中礦物表面EPS的成分和含量[5] Table1 EPS components and contents in ore residue during bioleaching of chalcopyrite concentrate by mixed culture of moderately thermophilic microorganisms[5]

圖1 藻酸鹽單體和基石的結(jié)構(gòu)[12] Fig.1 Structures of alginates monomers and blocks[12]

圖2 激光共聚焦掃描電鏡Z系列下觀察到的生物膜結(jié)構(gòu)[13] Fig.2 Z series projections of ungrazed (left side of dotted line in image) and grazed (right side) areas of biofilm visualized by CLSM[13] (Far red image of algal autofluorescence (647 nm ex); Green image of nucleic acid stained bacteria labeled by SYTO 9; Red channel image of TRITC conjugated lectin labeled polymer (588 nm ex,605/32 nm em))

1.2 藻酸鹽的作用

目前，藻酸鹽已經(jīng)成為一種重要的工業(yè)化生產(chǎn)的微生物多糖，它最初的作用是在肺炎致病菌如銅綠假單胞菌菌株中發(fā)現(xiàn)，具體包含以下幾點(diǎn)：

1) 加強(qiáng)細(xì)菌對固體表面的粘附。在Ca2+等金屬離子的誘導(dǎo)作用下，產(chǎn)生的細(xì)菌藻酸鹽發(fā)生分子自組裝，隨濃度的增加具有形成大的網(wǎng)狀聚集體的趨勢，作為生物膜的主要結(jié)構(gòu)成分，使微菌落鑲嵌其間。并可通過與細(xì)菌細(xì)胞膜作用而附著在細(xì)菌表面。已發(fā)生聚集的藻酸鹽還可通過相互之間的短程作用力(如氫鍵)進(jìn)一步組裝，形成粒徑更大的聚集體，成為細(xì)菌細(xì)胞黏附的重要介質(zhì)[12]。

2) 作為一保護(hù)屏障，保護(hù)細(xì)菌避免與抗生素和免疫攻擊物接觸，提高菌種抗性。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，銅綠假單胞菌分泌的高分子量的藻酸是造成患囊性纖維化病人肺感染的原因。藻酸包裹著菌體附著在肺表面，形成一道牢固的屏障阻止抗微生物藥物的穿透。只有使用藻酸鹽裂合酶將藻酸解聚，才能對病人進(jìn)行治療。ALKAWASH等[14]研究銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)時(shí)還發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)EPS中藻酸鹽含量較高時(shí)，該菌對抗生素類殺菌劑的抗性增強(qiáng)。當(dāng)采用藻酸鹽裂解酶處理該菌EPS后，該菌的抗性急劇下降，說明EPS中藻酸鹽在提高菌種抗性方面也起到了重要作用。

隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)藻酸鹽的每一個(gè)糖醛酸殘基中都有帶電基團(tuán)—COO-[12]。藻酸鹽分子含有M-M、G-G和G-M鏈段，各鏈段與金屬的結(jié)合能力主要取決于分子的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)及金屬離子的半徑和所帶的電荷。G-G嵌段相鄰糖單元的羧基和糖苷鍵氧以及羥基氧在主鏈的同側(cè)，形成具有蛋殼形狀的空穴，非常適合金屬離子的嵌入。這一發(fā)現(xiàn)為礦物生物氧化機(jī)制的研究奠定了重要理論基礎(chǔ)。

在生物冶金基礎(chǔ)理論研究中，人們開始注重對浸礦菌藻酸鹽中的糖醛酸成分的研究。SAND等[15]指 出，生物浸出的過程就是界面作用的結(jié)果，由糖醛酸富集溶液中的Fe3+，在礦物表面和細(xì)菌之間形成的微氧化空間中氧化溶解礦物。比較在FeSO4溶液中與黃鐵礦中生長的細(xì)菌所產(chǎn)生的胞外聚合物數(shù)量，在黃鐵礦中生長的細(xì)菌所產(chǎn)生的胞外聚合物的數(shù)量大約為FeSO4溶液中的3倍，但二者的胞外聚合物的成分是相似的，均存在有Fe3+、糖醛酸以及中性多糖，且Fe3+與糖醛酸的物質(zhì)的量的比為1:2[16]。2003年， KINZLERA等[17]指出，由亞鐵或黃鐵礦培養(yǎng)的鐵氧化菌中，胞外聚合物中的糖醛酸成分普遍存在，而在硫培養(yǎng)的硫氧化菌菌種中，卻不存在糖醛酸成分。而在2006年，HAMEIT等[18]對A. ferrooxidans,Acidithiobacillus thiooxidans和Leptospirillum ferrooxidans的EPS組成進(jìn)行化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們均含糖醛酸。但組成因菌株和生長基質(zhì)不同而有很大差異。分析3種菌發(fā)現(xiàn)，由亞鐵或黃鐵礦培養(yǎng)的鐵氧化菌A. ferrooxidans,L.ferrooxidans的EPS中能檢測到三價(jià)鐵離子，而A. thiooxidans的EPS中檢測不到。

1.3 藻酸鹽的生物合成途徑

PINDAR等[19]測定了棕色固氮菌生物合成細(xì)菌藻酸鹽所必需的酶，這些酶包括葡糖激酶、果糖激酶、磷酸甘露糖異構(gòu)酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶和GDP-甘露糖脫氫酶。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合海藻酸鹽生物合成途徑，提出了棕色固氮菌細(xì)菌藻酸鹽的生物合成途徑，藻酸鹽的生物合成是由果糖-6-磷酸開始的。

MAY等[20]進(jìn)一步說明了藻酸鹽的生物合成途徑，繪制了細(xì)菌藻酸鹽基因簇的遺傳圖譜，并探究藻酸鹽合成過程中涉及的分子和酶的作用，基因表達(dá)調(diào)控和環(huán)境因素的影響。

LYNN等[21]分別用含有放射性同位素14C標(biāo)記葡萄糖，認(rèn)為合成細(xì)菌藻酸鹽過程中E-D途徑起著重要作用。ANDERSON等[22]用含有放射性同位素14C標(biāo)記的[1-14C]果糖和[6-14C]果糖分別作為唯一碳源，培養(yǎng)棕色固氮菌SM52B生產(chǎn)細(xì)菌藻酸鹽，結(jié)果來自[1-14C]果糖和[6-14C]果糖的放射性同位素14C均大量進(jìn)入細(xì)菌藻酸鹽中。ANDERSON等[22]認(rèn)為細(xì)菌藻酸鹽的大量產(chǎn)生，主要是由果糖以完整己糖單位的形式聚合而成的。

綜上所述，胞外多聚物中的藻酸鹽的合成途徑如圖3所示。藻酸鹽的合成始于果糖-6-磷酸(F6P)，在磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)作用下生成甘露糖-6-磷酸(M6P)，然后在磷酸甘露糖酶(PMM)作用下生成甘露糖-1-磷酸(M1P)， 進(jìn)一步在GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)、GDP-甘露糖脫氫酶(GMD)作用下生成GDP-甘露糖(GDPM)和GDP-甘露糖醛酸(GDPMA)。圖3中箭頭1234分別代表聚合、乙?；?、輸出和差向異構(gòu)化。GDP-甘露糖醛酸被糖基載體脂即十一聚類異戊二烯醇磷酸脂運(yùn)往胞外，先合成聚甘露糖醛酸。然后在胞 外聚甘露糖醛酸C-5-差向異構(gòu)酶的作用下將聚甘露糖醛酸中的甘露糖醛酸部分異構(gòu)化，轉(zhuǎn)化為古洛糖醛酸殘基[23]。該酶的活性需要激活劑Ca2+。提高培養(yǎng)基中的Ca2+濃度，可增加胞外多糖中古洛糖醛酸的含量。位于圖3中方框上端的是編碼各種酶的基因，其中基因algA編碼PMI和GMP兩種酶。

2 研究藻酸鹽的關(guān)鍵技術(shù)與手段

2.1 藻酸鹽的提取及分析方法

微生物胞外多聚物中藻酸鹽的提取方法主要包括物理提取法和化學(xué)試劑法。物理提取法主要是利用各種外力如重力、離心力增加成分在溶液中的溶解度，如超聲波法、高速離心法?；瘜W(xué)試劑法是利用離子或分子的作用使成分可溶性增加，如NaOH法、EDTA法。1966年，LINKE等[10]首次發(fā)現(xiàn)假單胞菌多糖的藻酸鹽，其組成與海藻多糖類似，他采用紙層析、紅外光譜法等提取和分離藻酸鹽成分，然后用咔唑比色法分析糖醛酸含量，苯酚硫酸法分析多糖含量。KASHEF等[24]也介紹了銅綠假單胞菌中藻酸鹽提取的方法，以及成分的化學(xué)分析。王琳等[25]為探尋細(xì)菌藻酸鹽對好氧污泥顆?；淖饔茫梃b海藻酸鹽的提取方法， 對好氧顆粒污泥中的細(xì)菌藻酸鹽提取和鑒定。提取物鑒別反應(yīng)如下：1%提取物溶液中加 CaCl2溶液產(chǎn)生凍膠狀的沉淀；加飽和硫酸銨溶液不產(chǎn)生沉淀；加稀硫酸產(chǎn)生凍膠狀的沉淀；加酸式硫酸鐵溶液顯櫻桃紅色；加間苯三酚-鹽酸試液顯紅紫色。當(dāng)鑒別反應(yīng)均呈陽性時(shí)，根據(jù)FAO的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，可以判斷提取物為藻酸鹽。而接種污泥中不含褐藻，因此該藻酸鹽由細(xì)菌產(chǎn)生。此法也可應(yīng)用于浸礦菌提取的藻酸鹽的鑒定。本文作者課題組前期采用玻璃珠振蕩、超聲波等方法提取了生物浸出過程中的礦物表面的胞外多聚物，經(jīng)過GC-MS等方法分析了其中藻酸鹽的主要成分糖醛酸的含量及其隨生物浸出的變化情況，為研究胞外多聚物在生物浸出過程中的作用提供了重要理論基礎(chǔ)[5,26-27]。

2.2 藻酸鹽相關(guān)基因的定量研究方法

有關(guān)藻酸鹽的基因定量表達(dá)研究可采取以下幾種手段：

圖3 藻酸鹽生物合成途徑[20] Fig.3 Biosynthesis pathway of alginate[20]

1) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time polymerase chain reaction,RT-PCR)。實(shí)時(shí)熒光定量是近幾年新發(fā)展起來的方法，以RNA為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,由人工合成引物介導(dǎo)生成cDNA第一鏈,以此再作為聚合酶鏈反應(yīng)的模板,在TaqDNA聚合酶作用下,擴(kuò)增產(chǎn)生大量DNA片斷。RT-PCR是一種常用的具有很高靈敏度和特異性的基因表達(dá)檢測方法[28]。該方法理論上有一個(gè)單拷貝cDNA模板即可完成擴(kuò)增,因此，它比較適合作基因表達(dá)的定量研究。

2) 常見的還有Northern雜交法。雜交法由ALWINE等[29]在Southern技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。是用DNA探針來檢測特異序列的RNA。具體的步驟為首先從要研究的組織或細(xì)胞中抽提完整RNA，然后將RNA變性瓊脂糖凝膠電泳分離,再通過毛細(xì)管作用或負(fù)壓法裝置使 RNA條帶轉(zhuǎn)移到纖維膜上,進(jìn)行必要的處理后，用32P 標(biāo)記的DNA探針與纖維膜進(jìn)行雜交,在放射自顯影情況下可檢測出特定的 RNA條帶。這種方法主要是檢測特異mRNA，以分析該基因的表達(dá)情況及mRNA的分子大小,特別是對細(xì)胞生長、分化、發(fā)育過程中有關(guān)基因的表達(dá)。該方法具有較高的特異性。

3) S1核酸酶保護(hù)法(S1 nuclease protection)。S1核酸酶保護(hù)法是BERK和SHARP[30]開發(fā)的一種新的實(shí)驗(yàn)技術(shù),其程序是首先將未標(biāo)記的RNA高特異性活性32P標(biāo)記的DNA雜交，然后用核酸內(nèi)切酶S1處理雜交分子,在適當(dāng)?shù)臈l件下單鏈核苷酸被水解,而雜交雙鏈不受影響。最后，在堿性的瓊脂糖凝膠電泳中可精確地檢測出被保護(hù)的互補(bǔ)的單鏈DNA的片段大小，并通過運(yùn)用一系列的重疊的DNA限制片段,這個(gè)被鑒定出的轉(zhuǎn)錄子就可準(zhǔn)確定位。與Northern blot相比,該技術(shù)使用了間接的方法來定位和檢測mRNA，主要用于基因表達(dá)調(diào)控方面的研究，對于詳細(xì)地闡述真核細(xì)胞基因表達(dá)和表達(dá)的調(diào)節(jié)十分重要。

4) 田余祥等[31]用高效毛細(xì)管電泳法(High performance capillary electrophoresis,HPCE)用于基因表達(dá)產(chǎn)物的定量分析上，目的是想尋求一種能利用統(tǒng)計(jì)學(xué)對基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析比較的方法。

以上4種方法都常用于藻酸鹽合成基因的定量表達(dá)研究。其中，RT-PCR技術(shù)由于操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地用于基因的差異表達(dá)分析、SNP檢測、等位基因的檢測等。Northern雜交法主要用于mRNA的特異表達(dá)檢測，而S1核酸酶保護(hù)法使用了間接的方法來定位和檢測 mRNA，主要用于基因表達(dá)調(diào)控方面的研究，它對于分析真核細(xì)胞基因表達(dá)和調(diào)節(jié)十分重要。高效毛細(xì)血管法則是針對基因表達(dá)產(chǎn)物的分析。一般來說，基因表達(dá)定量分析方法的選擇主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)對象和設(shè)備等情況來判斷。

2.3 藻酸鹽原位觀察手段及方法

近年來，國內(nèi)外多采用多種電鏡組合技術(shù)和光譜學(xué)方法研究生物膜，主要包括激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、拉曼顯微鏡技術(shù)(CRM)、核磁共振光譜技術(shù)(MRI)、環(huán)境掃描電鏡(ESEM)、場發(fā)射掃描電鏡(FESEM)、原子力顯微鏡(AFM)和熒光顯微鏡(EFM)等。BRIDIER等[32]提出了一種高通量研究生物膜形成和結(jié)構(gòu)的方法，將CLSM同96孔板結(jié)合起來，具有高分辨率，能更清晰地研究生物膜的結(jié)構(gòu)。ZHANG等[33]采用CLSM、SEM、AFM等研究了生物浸出過程中極端嗜酸古菌Ferroplasma acidiphilum在礦物表面的聚集現(xiàn)象和生物膜的形成，F(xiàn). acidiphilum菌能在黃鐵礦表面快速形成生物膜，其細(xì)胞的分布、生物膜的形成以及EPS的產(chǎn)量都可較為清晰地觀察到。WAGNER等[34]利用CRM作為CLSM的輔助手段，對生物膜基質(zhì)進(jìn)行更為詳細(xì)的分析。GARNY等[35]將共聚焦激光掃描電鏡技術(shù)與核磁共振光譜技術(shù)結(jié)合起來，用于研究生物膜的結(jié)構(gòu)、組成和分子流動(dòng)性。BRIDIER等[36]利用一系列顯微鏡技術(shù)包括CLSM、ESEM和FESEM來分析生物膜周圍基質(zhì)的三維空間排布。不同技術(shù)的組合克服了單個(gè)技術(shù)的限制，使我們對生物膜結(jié)構(gòu)有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

同時(shí)，也可以借鑒這些廣泛應(yīng)用在生物膜和EPS上的方法，將它們應(yīng)用在藻酸鹽研究上。LAWRENCE等[13]利用藻酸鹽自發(fā)熒光，通過CLSM可以較為準(zhǔn)確、特異性地分析EPS中藻酸鹽的含量，從而為實(shí)時(shí)定量分析關(guān)鍵胞外多糖藻酸鹽成分奠定了基礎(chǔ)。HENTZER等[37]研究了藻酸鹽過度表達(dá)對生物膜結(jié)構(gòu)和功能的影響，用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記菌株生物膜，利用CLSM觀察生物膜形態(tài)。DAVIESANDG 等[38]用激光掃描共聚焦顯微鏡原位檢測藻酸鹽操縱子algC轉(zhuǎn)錄融合產(chǎn)物β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)情況。

在今后藻酸鹽的研究中應(yīng)結(jié)合多種組學(xué)技術(shù)，從分子生物學(xué)角度探討其生物作用和形成途徑，進(jìn)一步了解藻酸鹽在細(xì)菌與礦物界面中的作用，為提高浸礦速率、縮短浸礦周期提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，藻酸鹽是胞外多聚物中的關(guān)鍵組成成分，通過參考廢水處理等領(lǐng)域的藻酸鹽研究方法與手段，分析生物浸出過程中藻酸鹽的含量變化、原位分布、基因表達(dá)等情況，從而揭示胞外多聚物關(guān)鍵組分藻酸鹽的作用機(jī)理，為闡明微生物浸礦行為奠定基礎(chǔ)。

3 展望

藻酸鹽是胞外多聚物的關(guān)鍵組分，它在維持生物膜結(jié)構(gòu)和功能方面有重要的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、顯微觀察技術(shù)和光譜技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物生物膜中藻酸鹽的微觀結(jié)構(gòu)逐步被人們所認(rèn)識(shí)，尤其是在醫(yī)學(xué)微生物、環(huán)境微生物研究等方面，藻酸鹽在生物膜中的作用及其機(jī)理逐步被闡明。但是在生物冶金領(lǐng)域，礦物表面胞外多聚物關(guān)鍵組分如藻酸鹽的研究一直是個(gè)盲區(qū)，不利于探索礦物生物氧化的微觀行為，較大程度上阻礙了生物冶金理論的發(fā)展。未來生物冶金界面研究方向?qū)⑹歉⒂^、更深層次地探討胞外多聚物組分及其作用機(jī)理，如胞外多聚物關(guān)鍵組分藻酸鹽、胞外蛋白、胞外DNA等在礦物表面的含量、分布規(guī)律和功能地位。這些將有助于了解生物浸出不同時(shí)期胞外多聚物關(guān)鍵組分的生成情況，結(jié)合礦物氧化中間產(chǎn)物、微生物生態(tài)、微生物功能基因表達(dá)等方面的分析，從而更系統(tǒng)地、科學(xué)地揭示微生物的浸礦行為。

[1] 余潤蘭,石麗娟,周 丹,邱冠周,曾偉民. 生物浸出過程中微生物協(xié)同作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國有色金屬學(xué)報(bào),2013,23(10): 3010-3014.

YU Run-lan,SHI Li-juan,ZHOU Dan,QIU Guan-zhou,ZENG Wei-min. Research development of microorganism synergy mechanisms during bioleaching[J]. The Chinese Journal of Nonferrous Metals,2013,23(10): 3010-3014 .

[2] RAWLINGS D E. Heavy metal mining using microbes[J]. Annual Review of Microbiology,2002,56(1): 65-91.

[3] 王朝華,陸建軍,陸現(xiàn)彩,李 娟. 微生物胞外聚合物特征組分影響黃鐵礦分解作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 巖石礦物學(xué)雜志,2009,28(6): 553-558.

WANG Zhao-hua,LU Jian-jun,LUN Xian-cai,LI Juan. The effects of the typical components of extracellular polymeric substances (EPS) of microorganism on the bio-decomposition of pyrite[J]. Acta Petrologica et Mineralogica,2009,28(6): 553-558.

[4] SCHIPPERS A,HEDRICH S,VASTERS J,DROBE M,SAND W,WILLSCHER S. Biomining: Metal recovery from ores with microorganisms[C]// Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. Berlin,Germany: Springer,2013: 1-47.

[5] ZENG Wei-min,QIU Guan-zhou,ZHOU Hong-bo,LIU Xue-duan,CHEN Miao,CHAO Wei-liang,ZHANG Cheng-gui,PENG Juan-hua. Characterization of extracellular polymeric substances extracted during the bioleaching of chalcopyrite concentrate[J]. Hydrometallurgy,2010,100(3/4): 177-180.

[6] RYDER C,BYRD M,WOZNIAK D J. Role of polysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm development[J]. Current Opinion in Microbiology,2007,10(6): 644-648.

[7] FLEMMING H C,WINGENDER J. The biofilm matrix[J]. Nature Review of Microbiology,2010,8(9): 623-633.

[8] SAND W,GEHRKE T. Extracellular polymeric substances mediate bioleaching/biocorrosion via interfacial processes involving iron(Ⅲ) ions and acidophilic bacteria[J]. Research in Microbiology,2006,157(1): 49-56.

[9] GORIN P A J,SPENCER J F T. Exocellular alginic acid from Azotobacter vinelandii[J]. Canadian Journal of Chemistry,1966,44: 993-998.

[10] LINKER A,JONES R S. A new polysaccharide resembling alginic acid isolated from pseudomonads[J]. The Journal of Biological Chemistry,1966,24(16): 3845-3851.

[11] BRUUS J H,NIELSEN P H,KEIDING K. On the stability of activated sludge flocs with implications to dewatering[J]. Water Research,1992,26(12):1597–1604.

[12] 林躍梅. 好氧顆粒污泥中細(xì)菌藻酸鹽的研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué),2007: 1-147.

LIN Yue-mei. Studies on bacterial alginates in aerobic granules[D]. Qingdao: Ocean University of China,2007: 1-147.

[13] LAWRENCE J R,NEU T R,SWERHONE G D W. Application of multiple parameter imaging for the quantification of algal,bacterial and exopolymer components of microbial biofilms[J]. Journal of Microbiological Methods,1998,32(3): 253-261.

[14] ALKAWASH M A,SOOTHILL J S,SCHILLER N L. Alginate lyase enhances antibiotic killing of mucoid Pseudomonas aeruginosa in biofilms[J]. Acta Pathologica,Microbiologica,et Immunologica Scandinavica,2006: 114(2): 131-138.

[15] SAND W,GEHRKE T. Extracellular polymeric substances mediate bioleaching/biocorrosion via interfacial processes involving iron(Ⅲ) ions and acidophilic bacteria[J]. Research in Microbiology,2006,157(2): 49-56.

[16] 鐘代立. A.f菌胞外聚合物表面性質(zhì)隨培養(yǎng)基質(zhì)和時(shí)間的演變研究[D]. 長沙: 中南大學(xué),2011: 1-70.

ZHONG Dai-li. Evolvement of surface property of extracellular polymeric substances of A.ferrooxidans with culture and time[D]. Changsha: Central South University,2011: 1-70.

[17] KINZLERA K,GEHRKEA T,TELEGDIB J,SAND W. Bioleaching—A result of interfacial processes caused by extracellular polymeric substances(EPS)[J]. Hydrometallurgy,2003,71(1/2): 83-88.

[18] HAMEIT K,GOKSEL A,KOCK D,KLOCK JH,GEHRKE T,SAND W. Adhesion to metal sulfide surfaces by cells of Acidithiobacillus ferrooxidans,Acidithiobacillus thiooxidans and Leptospirillum ferrooxidans[J]. Hydrometallurgy,2006,83(1/4): 245-254.

[19] PINDER D F,BUCKE C. The biosynthesis of alginic acid by Azotobacter vinelandii[J]. Biochemical Journal,1975,152(3): 617-622.

[20] MAY T B,SHINABARGER D. Alginate synthesis by Pseudomonas aeruginosa: A key pathogenic factor in chronic pulmonary infections of cystic fibrosis patients[J]. Clinical Microbiology Reviews,1991,4(2): 191-206.

[21] LYNN A R,SOKATCH J R. Incorporation of isotope from specifically labeled glucose into alginates of Pseudomonas aeruginosa and Azotobacter vinelandii[J]. Bacteriol,1984,158(3): 1161-1162.

[22] ANDERSON A J,HACKING A J,DAWES E A. Alternative pathways for the biosynthesis of alginate from fructose and glucose in Pseudomonas mendocina and Azotobacter vinelandii[J]. Journal of General Microbiology,1987,133(4): 1045-1052.

[23] 邱立友. 細(xì)菌藻酸鹽研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào),1994,21(6): 360-363.

QIU Li-you. Research progress in bacterial alginate[J]. Microbiology China,1994,21(6): 360-363.

[24] KASHEF N,QORBAN B N. Preliminary investigation on the isolation of alginate produced by mucoid Pseudomonas aeruginosa[J]. Annals of Microbiology,2005,55(4): 279-282.

[25] 林躍梅,王 琳. 好氧顆粒污泥藻酸鹽提取物的聚集形態(tài)研究[J]. 環(huán)境科學(xué),2008,29(5): 1181-1186.

LIN Yue-mei,WANG Lin. Self-aggregation property of bacterial alginates extracted from aerobic granules[J]. Environmental Science,2008,29(5): 1181-1186.

[26] ZENG Wei-min,CHEN Miao,TAN S,QIU Guan-zhou. Detection and analysis of attached microorganisms on the mineral surface during bioleaching of pure chalcopyrite with moderate Thermophiles[J]. Hydrometallurgy,2011,106(1/2): 46-50.

[27] 曾偉民. 黃銅礦生物浸出過程中鈍化膜的形成機(jī)制及其消除方法探討[D]. 長沙: 中南大學(xué),2011: 1-147.

ZENG Wei-min. The formation mechanism of passivation layer and its elimination way during bioleaching of chalcopyrite[D]. Changsha: Central South University,2011: 1-147.

[28] ZHANG R B,WEI M M,JI H G,CHEN X H,QIU G Z,ZHOU H B. Application of real-time PCR to monitor population dynamics of defined mixed cultures of moderate Thermophiles involved in bioleaching of chalcopyrite[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2009,81(6): 1161-1168.

[29] ALWINE J C,KEMP D J,STARK G R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,1977,74(12): 5351-5354.

[30] BERK A J,SHARP P A. Sizing and mapping of early adenovirus mRNAs by gel electrophoresis of S1 endonuclease-digested hybrids[J]. Cell,1977,12(3): 721-732.

[31] 田余祥,于秀萍,崔秀云. 基因表達(dá)的一種定量研究方 法——高效毛細(xì)管法[J]. 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1997,19(1): 5-7.

TIAN Yu-xiang,YU Xiu-ping,CUI Xiu-yun. A quantitative method of gene expression—High performance capillary electrophoresis method[J]. Journal of Dalian Medical University,1997,19(1): 5-7.

[32] BRIDIER A,BRISSONNET F D,BOUBETRA A,THOMAS V,BRIANDET R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method[J]. Journal of Microbiological Methods,2010,82(1): 64-70.

[33] ZHANG R,BELLENBERG S,CASTRO L,NEU T R,SAND W,VERA M. Colonization and biofilm formation of the extremely acidophilic archaeon Ferroplasma acidiphilum[J]. Hydrometallurgy,2014,150: 245-252.

[34] WAGNER M,NATALIA P. IVLEVA,HAISCH C,NIESSNER R,HORN H. Combined use of confocal laser scanning microscopy (CLSM) and Raman microscopy (RM): Investigations on EPS-Matrix[J]. Water Research,2009,43(1): 63-76.

[35] GARNY K,NEU T R,HORN H,VOLKE F,MANZ B. Combined application of13C NMR spectroscopy and confocal laser scanning microscopy-Investigation on biofilm structure and physico-chemical properties[J]. Chemical Engineering Science,2010,65(16): 4691-4700.

[36] BRIDIER A,MEYLHEUC T,BRIANDET R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM,ESEM and FESEM)[J]. Micron,2013,48: 65-69.

[37] HENTZER M,TEITZEL G M,BALZER G T,HEYDORN A,MOLIN S,GIVSKOV M,PARSEK M R. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function[J]. Journal of Bacteriology,2001,183(18): 5395-5401.

[38] DAVIESANDG D G,GEESEY G. Regulation of the alginate biosynthesis gene algC in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology,1995,61(3): 860-867.