單曉楓 ，康元環(huán)，夏京津，龍繼兵，陳 龍，王 惠，曹 亮，孟慶峰，錢愛東

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長春 130062）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，AV）是一種人-獸-魚共患病原菌，其廣泛存在于水體及土壤之中，是動物腸道和自然生態(tài)系統(tǒng)的正常菌群之一[1]。該菌有致病性菌株與非致病性菌株之分，近年來，有關(guān)致病性菌株所引發(fā)的人、哺乳動物、水生動物疾病的報(bào)道逐漸增多，嚴(yán)重威脅了人類的健康，并給養(yǎng)殖業(yè)尤其是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[2-6]。但是，有關(guān)維氏氣單胞菌的研究在國內(nèi)尚處于起步階段，尤其缺少系統(tǒng)性與深入性的研究。鑒于此，本試驗(yàn)選取8 株不同動物源性的維氏氣單胞菌，并對其染色特性、理化特性、培養(yǎng)特性、耐藥性、不同pH值、溫度、滲透壓對其生長的影響以及16SrRNA序列的相似性等生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究，研究結(jié)果，將為維氏氣單胞菌的檢驗(yàn)檢疫、疾病預(yù)防奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為該菌的深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種 維氏氣單胞菌WL161 株（烏鱧源）、NJ4112-4株（鯽魚源）、NC4122-3株（草魚源）、NN725株（鯰魚源）、CY0806 株（鯉魚源），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；CVCC3700 株（狐源），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；QXF0711B株（青蝦源）由浙江省淡水水產(chǎn)研究所潘曉藝副研究員惠贈；標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35624（人源）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、DL-2 000 DNAMarker，購自TaKaRa 公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；RS鑒別培養(yǎng)基，購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；HE 培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、抗菌藥物藥敏試紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 菌種的復(fù)蘇 將實(shí)驗(yàn)室保存的8株維氏氣單胞菌凍干粉，接種于TSB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，將菌株復(fù)蘇，取該復(fù)蘇菌液劃線接種于RS鑒別培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)18～24 h 后挑取特征性菌落再次接種于TSB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌體形態(tài)特征觀察 將復(fù)蘇并純化的8 株維氏氣單胞菌接種于TSB培養(yǎng)基中，待生長至對數(shù)生長期及老齡期時(shí)，進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡觀察其菌體形態(tài)。

1.5 理化特性 將復(fù)蘇的維氏氣單胞菌分別接種于微量生化反應(yīng)管中，其中CVCC3700株、ATCC35624標(biāo)準(zhǔn)株于37 ℃培養(yǎng)，其余菌株30 ℃培養(yǎng)，具體操作參見微量生化反應(yīng)管說明書。

1.6 培養(yǎng)特性觀察 取復(fù)蘇的細(xì)菌分別劃線接種于HE 培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、RS培養(yǎng)基、TCBS培養(yǎng)基等8種不同瓊脂平板上，CVCC3700株、ATCC35624標(biāo)準(zhǔn)株于37 ℃培養(yǎng)24 h，其余菌株30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落形態(tài)。

1.7 不同pH 值、溫度、滲透壓對細(xì)菌生長的影響將復(fù)蘇的菌液稀釋至一定濃度，接種于TSB培養(yǎng)基中，觀察不同pH 值、培養(yǎng)溫度、滲透壓等對不同源性維氏氣單胞菌生長的影響，具體操作參照參考文獻(xiàn)[7]。

1.8 藥敏試驗(yàn) 選取22 種抗生素的藥敏紙片，分析不同源性維氏氣單胞菌對抗生素的耐藥性，具體操作按藥敏紙片說明書進(jìn)行。

1.9 16SrRNA序列的測定與遺傳演化分析 以不同菌株的基因組DNA為模板，引物為細(xì)菌16SrRNA的通用引物（27F、1492R），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果通過BLAST 進(jìn)行比對，并使用Mega4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 菌體形態(tài)特征觀察 經(jīng)革蘭染色、鏡檢，8 株不同源性的維氏氣單胞菌在對數(shù)生長期菌體形態(tài)差異不大，均為革蘭陰性短桿菌、單在或成對、略有彎曲，部分菌株（CVCC3700 株、WL161 株）在對數(shù)生長期即呈現(xiàn)多形性、長絲狀與短桿狀并存；在老齡培養(yǎng)物中均出現(xiàn)多形性現(xiàn)象，但長絲狀菌體形態(tài)所占比例的多少、不同菌株存在一定差異。

2.2 理化特性 8 株不同維氏氣單胞菌菌株的理化特性基本一致，酒石酸鹽、明膠液化、D-甘露醇、賴氨酸脫羥酶、D-半乳糖、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羥酸、DNA酶、D-葡萄糖產(chǎn)酸、蔗糖、麥芽糖、ONPG、吲哚、V-P 試驗(yàn)、硝酸鹽還原、氧化酶等均為陽性反應(yīng)；硫化氫、尿素水解、苯丙胺酸脫氨酶、乳糖、L-阿拉伯糖、甘油、肌醇、衛(wèi)茅醇等為陰性反應(yīng)；但枸櫞酸鹽利用、水楊素、七葉苷、M.R.等因菌株不同而存在差異。

2.3 培養(yǎng)特性觀察 8 株不同源性維氏氣單胞菌經(jīng)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，分別呈現(xiàn)不同的菌落特征、且不同菌株在同一培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)基本一致（表1），但在RS鑒別培養(yǎng)基上：ATCC35624株菌落呈現(xiàn)暗綠色、CY0806 株菌落呈現(xiàn)黃色、其余呈現(xiàn)淡黃色菌落。

2.4 不同溫度對維氏氣單胞菌生長的影響 將8株維氏氣單胞菌復(fù)蘇、稀釋至一定濃度、接種于TSB培養(yǎng)基中，分別于25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，4 ℃培養(yǎng)7 d。結(jié)果如下：在25 ℃～40 ℃范圍內(nèi)，除ATCC35624 株、CY0806 株每毫升的活菌含量略有下降外，大多數(shù)菌株生長良好；在42 ℃，所有菌株的生長都略受到抑制，但仍可生長繁殖；在4 ℃培養(yǎng)7 d，所有菌株均可生長繁殖。

表1 維氏氣單胞菌在不同培養(yǎng)基的生長特征

2.5 不同pH 值對維氏氣單胞菌生長的影響 將復(fù)蘇的8 株維氏氣單胞菌接種于不同pH 值的TSB培養(yǎng)基中、30 ℃培養(yǎng)24 h，得到如下結(jié)果：所有菌株均可在pH 值6～9 范圍內(nèi)存活并生長，少數(shù)菌株（WL161、CY0806）可以耐受pH 值為4、5 或10 的酸堿。

2.6 不同滲透壓對維氏氣單胞菌生長的影響以氯化鈉添加量為滲透壓的試驗(yàn)量、接種復(fù)蘇的維氏氣單胞菌，結(jié)果顯示，所有菌株均可在氯化鈉含量為0%～4%的TSB中生長良好、在6%氯化鈉中不能存活；部分菌株（ATCC35634、WL161、NN725、CY0806）可以耐受5%的氯化鈉含量。

2.7 藥敏試驗(yàn) 8 株維氏氣單胞菌均對青霉素G、克林霉素、萬古霉素、多粘菌素B、氨芐西林、新生霉素等表現(xiàn)出耐藥性；對頭孢克肟、洛美沙星、頭孢曲松、奧復(fù)星、單環(huán)菌素等比較敏感；對其余的抗生素則因菌株差異、耐藥性也不盡相同；其中菌株NN725對多種抗生素表現(xiàn)出耐藥性（表2）。

2.8 不同動物源維氏氣單胞菌16SrRNA基因遺傳演化分析 利用MEGA5.1 軟件對不同動物源維氏氣單胞菌16SrRNA基因的遺傳演化進(jìn)行分析：ATCC35624、NC4122-3、WL161 親緣關(guān)系較近處于同一大分支；其余5 株聚成一簇、處于一大分支。

圖1 不同宿主來源維氏氣單胞菌16SrRNA基因進(jìn)化分析

3 討論

作為一種較新型的人-獸-魚共患病原菌，維氏氣單胞菌引發(fā)多種動物疾病的報(bào)道日益增多[1-6]，但有關(guān)其生物學(xué)特性的報(bào)道并不多見，本實(shí)驗(yàn)室曾對一株鯉源維氏氣單胞菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步探討[7]，但不同源性維氏氣單胞菌的生物學(xué)特性是否相似，則尚未見研究報(bào)道。因此，本研究針對實(shí)驗(yàn)室保存的8 種不同動物源性的維氏氣單胞菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為深入研究該菌提供一些數(shù)據(jù)支持。

表2 8株維氏氣單胞菌的耐藥性

本研究首先對其菌體形態(tài)進(jìn)行了初步觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌在老齡培養(yǎng)物中，多數(shù)菌株呈現(xiàn)多形性-即短桿狀與長絲狀并存，其中CVCC3700株、WL161 株尤為明顯，其在對數(shù)生長期就表現(xiàn)出了多形性。本實(shí)驗(yàn)室曾對環(huán)境中分離的維氏氣單胞菌菌體形態(tài)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的多形性是一種比較常見的狀態(tài)，這種情況在其他氣單胞菌尚未發(fā)現(xiàn)，是否可以作為檢測維氏氣單胞菌的一個條件，仍需進(jìn)一步大量菌株進(jìn)行論證。

對維氏氣單胞菌的培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究，從結(jié)果中可以看出，該菌可以在多種鑒別培養(yǎng)基上生長良好，這與本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)的研究結(jié)果相符[7]，但值得注意的是，不同源性的維氏氣單胞菌在RS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與顏色并不一致，這提醒我們在分離維氏氣單胞菌時(shí)，選用的鑒別培養(yǎng)基應(yīng)該慎重。

從不同培養(yǎng)溫度、pH值以及滲透壓對維氏氣單胞菌生長影響的結(jié)果可以看出，維氏氣單胞菌可以在較為廣泛的溫度、鹽度較高或者無鹽的環(huán)境中存活并生長；個別菌株還可以耐受較強(qiáng)的酸堿環(huán)境；尤其應(yīng)當(dāng)引起注意的是，維氏氣單胞菌可以在4 ℃條件下緩慢生長，這與González-Rodríguez 與Castro-Escarpulli 的研究結(jié)果相符[8-9]。綜合維氏氣單胞菌耐受能力測定結(jié)果說明，該菌的生存空間廣泛，不同環(huán)境中的動物、人均有可能接觸、甚至患病，因此研究結(jié)果具有一定的公共衛(wèi)生意義。

8 株維氏氣單胞菌對抗生素的耐藥性結(jié)果不盡相同，可能與菌株來源不同有著直接關(guān)系。其中，鲇魚源NN725 株的耐藥種類較多，說明抗生素的濫用會導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)，這應(yīng)當(dāng)引起人們的足夠重視。

雖然8 株維氏氣單胞菌16SrRNA基因序列有著較高相似性，但仍然存在著一定差異，不過這種差異有著一定的隨機(jī)性，與動物源性或者地域差異并不相關(guān)。

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