遲世凱，孫春玲，李華濤，叢 霞，姜忠玲，王 新，曹榮峰，田文儒

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

中獸醫(yī)認(rèn)為，高溫作為應(yīng)激因子對(duì)機(jī)體產(chǎn)生熱應(yīng)激乃至造成熱應(yīng)激綜合征，最后往往以腎功能衰竭而死亡[1]。黃芩苷（Baicalin）是從黃芩的干燥根中提取出的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一，其解熱作用顯著[2]，Tsai 等[3]研究認(rèn)為黃芩苷可能通過(guò)抑制下丘腦中N-甲基-D-天冬氨酸受體依賴羥基旁路和TNF-α的增加從而發(fā)揮其解熱作用。目前關(guān)于黃芩苷單體解熱方面的研究甚少，其解熱機(jī)制的研究也尚未深入，以黃芩為主藥的中藥復(fù)方解熱機(jī)制方面的研究也不多，且復(fù)方研究結(jié)果不能代表單味藥?，F(xiàn)已證明，多種體外培養(yǎng)的細(xì)胞和胚胎受熱后均能產(chǎn)生熱休克蛋白（HSP），HSP70 是HSPs 家族里含量最多，亦是最重要的一種非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白，尤其對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有顯著的抗熱保護(hù)作用[4-5]。劉萍等[6]研究表明，黃芩苷能夠促進(jìn)大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元HSP70 的表達(dá)，而黃芩苷能否調(diào)節(jié)熱應(yīng)激條件下的細(xì)胞合成HSP70，目前未發(fā)現(xiàn)有任何報(bào)道。因此，本研究擬探討不同濃度黃芩苷對(duì)熱應(yīng)激條件下豬腎小管上皮（LLC-PK1）細(xì)胞HSP70 表達(dá)的影響，以期為黃芩苷的解熱作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 黃芩苷，購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；高糖DMEM和胰蛋白酶，購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清，購(gòu)自HyClone 公司；RNA提取試劑盒，購(gòu)自原平皓生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、rTaqDNA聚合酶和DL-1 000 Marker，購(gòu)自TaKaRa公司；LightCycler?480 SYBR Green I Master，購(gòu)自Roche 公司；HSP70、GAPDH 抗體和兔抗羊IgGHRP 分別，購(gòu)自Santa Cruze 公司和Jackson ImmunoResearch 公司；BLUeye Prestained Protein Ladder，購(gòu)自GeneDireX 公司；Western 及IP 細(xì)胞裂解液、一抗二抗去除液和ECL 熒光底物試劑盒，購(gòu)自碧云天生物制品有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中收錄號(hào)為NM001123127的豬HSP70 基因序列和XM003357928豬β-Actin基因序列設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。序列如下：HSP70 Sense primer：5′-GCCCTGAATCCGCAGAATA-3′，Anti-sense primer：5′-TCCCCACGGTAGGAAACG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為152 bp；β-Actin：Sense primer：5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′，Anti-sense primer：5′-GGCCGTGATCTCCTTCTGC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為411 bp。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與試驗(yàn)分組 LLC-PK1 細(xì)胞為美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)第3 代細(xì)胞，購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。細(xì)胞用含12%胎牛血清的高糖DMEM在37 ℃、5% CO2的飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%～90%后傳代，傳代細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

試驗(yàn)分為Ⅰ組37 ℃常溫對(duì)照組，Ⅱ組42 ℃單純熱應(yīng)激1 h 組，而Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組和Ⅶ組分別添加0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL 和100 μg/mL 不同濃度黃芩苷培養(yǎng)24 h 后再將其42 ℃熱應(yīng)激1 h 組。

1.4 cDNA合成與PCR 擴(kuò)增電泳 按照RNA快速提取試劑盒（原平皓生物有限公司）說(shuō)明書，提取各組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司）說(shuō)明書，進(jìn)行RT 反應(yīng)。將合成的cDNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠（含0.5 g/L 溴化乙錠）電泳，由GDS-8000 凝膠成像分析系統(tǒng)拍照鑒定。

1.5 熒光定量PCR 檢測(cè)HSP70 基因的表達(dá) 將合成的cDNA產(chǎn)物做一系列濃度梯度稀釋，使用Roche LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR 儀進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為10 μL，其中包括：ddH2O23.6 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA1 μL。反應(yīng)條件為95 ℃10 min，95 ℃5 s 和58 ℃30 s，共45 個(gè)循環(huán)。

1.6 Western Blot 檢測(cè)HSP70 蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，混合2×SDS樣品緩沖液加熱變性后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，4℃條件下220 mA恒流濕轉(zhuǎn)2 h，再封閉2 h，按順序加入一抗二抗孵育后，用ECL 試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，最后用UVP 凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)，用AlphaView對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS16.0 軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD多重比較，均數(shù)間進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增 利用設(shè)計(jì)的HSP70 和β-Actin 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在152 bp 處擴(kuò)增到了一條HSP70 的條帶，在411 bp 處擴(kuò)增到了一條β-Actin的條帶，與預(yù)期值相符合，經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)其為目的基因產(chǎn)物。

2.2 HSP70 mRNAReal-time PCR 結(jié)果 各組細(xì)胞以β-Actin 做內(nèi)參基因，用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析后發(fā)現(xiàn)（圖1），與37 ℃常溫對(duì)照組相比，其他各組LLC-PK1 細(xì)胞HSP70 mRNA的表達(dá)量均升高，其中Ⅵ組和Ⅴ組差異極顯著（P＜0.01），其余各組差異顯著（P＜0.05）；與42 ℃單純熱應(yīng)激組相比，除Ⅰ組外，其余各組LLC-PK1 細(xì)胞HSP70 mRNA的表達(dá)量均升高，其中Ⅴ組差異極顯著（P＜0.01），Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ租和Ⅶ組差異顯著（P＜0.05）。

圖1 各組LLC-PK1細(xì)胞HSP70 m RNA相對(duì)表達(dá)量

圖2 HSP70和GAPDH蛋白電泳

圖3 各組LLC-PK1細(xì)胞HSP70 蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.3 HSP70 蛋白Western Blot 結(jié)果 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)的結(jié)果（圖2）用AlphaView軟件掃描其灰度，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)（圖3），與37 ℃常溫對(duì)照組相比，其他各組LLC-PK1 細(xì)胞HSP70 蛋白的表達(dá)量均升高，其中Ⅴ組差異極顯著（P＜0.01），其余各組差異顯著（P＜0.05）；與42℃單純熱應(yīng)激組相比，除Ⅰ組外，其余各組LLCPK1 細(xì)胞HSP70 蛋白的表達(dá)量均升高，但Ⅲ組和Ⅶ組差異不顯著，Ⅴ組差異極顯著（P＜0.01），Ⅳ組和Ⅵ組差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

細(xì)胞在受到高溫、缺氧及重金屬等應(yīng)激源刺激時(shí)，細(xì)胞過(guò)表達(dá)HSP70，而HSP70 能夠增加細(xì)胞自身對(duì)損害的耐受力，維持細(xì)胞正常功能代謝，提高其存活率[7]。因此，很多研究者嘗試過(guò)許多方法來(lái)增加細(xì)胞中HSP70 的表達(dá)[8-9]，從而提高細(xì)胞抗應(yīng)激的能力，但在培養(yǎng)液添加中草藥的單一成分來(lái)提高細(xì)胞的HSP70 表達(dá)的報(bào)道甚少，添加黃芩苷的尚無(wú)報(bào)道。

據(jù)報(bào)道黃芩苷具有清熱解毒、抗菌消炎、抗氧化、降壓，及鎮(zhèn)靜等作用[10]。而李倩楠[11]曾經(jīng)報(bào)道，高劑量黃芩苷（160 mg/kg）灌服能明顯降低發(fā)熱大鼠的體溫，并認(rèn)為黃芩苷可能通過(guò)抑制TNFA和IL-1B的產(chǎn)生或釋放，繼而引起IL-6 的改變，再使PGE2 合成減少,從而發(fā)揮解熱作用。趙紅艷[12]等研究表明，黃芩苷可以通過(guò)降低下丘腦中PGE2 和cAMP 的含量來(lái)起到解熱作用。

本試驗(yàn)42 ℃單純熱應(yīng)激1 h 能顯著誘導(dǎo)LLC-PK1 細(xì)胞HSP70 的表達(dá)，說(shuō)明42 ℃的溫度能夠引起細(xì)胞的熱休克反應(yīng)。與37 ℃常溫對(duì)照組相比，在LLC-PK1 細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的黃芩苷在1 μg/mL 以 下（0.01～1 μg/mL）時(shí)，細(xì)胞表達(dá)HSP70 的量隨黃芩苷濃度增加而升高，而當(dāng)黃芩苷濃度在1 μg/mL 以上（1～100 μg/mL）時(shí)，雖然細(xì)胞HSP70 表達(dá)呈降低趨勢(shì)，但仍顯著高于對(duì)照組，這說(shuō)明黃芩苷（0.01～100 μg/mL）能夠上調(diào)熱應(yīng)激條件下LLC-PK1 細(xì)胞HSP70 的表達(dá)。與42 ℃單純熱應(yīng)激組相比，黃芩苷（0.01～100 μg/mL)均能顯著增加細(xì)胞HSP70 mRNA的表達(dá)，但0.01 μg/mL 和100 μg/mL 黃芩苷對(duì)細(xì)胞HSP70 的蛋白表達(dá)無(wú)顯著性影響，首先，有研究表明[13]，真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)存在時(shí)空間隔，轉(zhuǎn)錄和翻譯還受到多種因素調(diào)控，因此mRNA的表達(dá)水平并不一定代表蛋白的表達(dá)水平；其次，極有可能因?yàn)?.01 μg/mL 的黃芩苷濃度太小，不足以誘導(dǎo)熱應(yīng)激條件下細(xì)胞HSP70 蛋白的表達(dá)，而100 μg/mL 的黃芩苷的濃度又過(guò)大，抑制了熱應(yīng)激條件下細(xì)胞HSP70 蛋白的持續(xù)高表達(dá)，所以，試驗(yàn)成功篩選出黃芩苷誘導(dǎo)熱應(yīng)激條件下LLCPK1 細(xì)胞HSP70 表達(dá)的最佳濃度范圍，即0.1～10 μg/mL，且1 μg/mL 的黃芩苷誘導(dǎo)效果最顯著。

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