仲慶振，王 丹，孫澤威，婁玉杰

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

作為動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)控物質(zhì)，促腎上腺皮質(zhì)激素、腎上腺皮質(zhì)激素、甲狀腺素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素等被稱(chēng)為“應(yīng)激激素”，并被作為評(píng)價(jià)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度的客觀指標(biāo)[1]。熱應(yīng)激蛋白70（Heat stress proteins 70，HSP70），可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的耐受性[2]。因此，在受到應(yīng)激刺激時(shí)，細(xì)胞能否適時(shí)產(chǎn)生足量的HSP70 是細(xì)胞功能狀態(tài)和抗應(yīng)激能力良好的重要生物學(xué)標(biāo)志[3]。

本試驗(yàn)通過(guò)放射免疫和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，測(cè)定鵝不同時(shí)間急性熱應(yīng)激處理血清激素水平和肝臟HSP70 mRNA的表達(dá)變化，揭示鵝在急性熱處理下鵝應(yīng)激指示激素和肝臟HSP70 mRNA的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為判斷鵝的熱應(yīng)激狀態(tài)和研究鵝的耐熱機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取1 日齡健康仔鵝60 只，隨機(jī)分成6 組，每組10 只，單籠飼養(yǎng)在環(huán)控倉(cāng)內(nèi)，自由采食及飲水。隨著日齡的增長(zhǎng)，逐漸將環(huán)境溫度下調(diào)至（22±1）℃。待飼養(yǎng)至8 周齡時(shí)，對(duì)照組仍置于（22±1）℃環(huán)境中，其余各組鵝突然施于2、4、6、8 h 和10 h（40±1）℃（相對(duì)濕度65%）的高溫處理，各組處理均在16：00 結(jié)束。

1.2 樣品采集 處理結(jié)束后，試驗(yàn)鵝全部屠宰取全血，室溫靜置30 min，3 500 r/min 離心10 min 分離血清，-20 ℃保存、待測(cè)；取100 mg 左右肝臟迅速投入液氮速凍后置-80 ℃保存待測(cè)。

1.3 激素測(cè)定 INS、COR、T3、T4的含量采用放射免疫分析法，按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，γ放射免疫計(jì)數(shù)器為中國(guó)科大中佳公司GC-2016 型。

1.4 肝臟HSP70 mRNA測(cè)定

1.4.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 利用TRIZol 試劑盒提取總RNA后，使用SYBR ExScriptTMRTPCR Kit（寶生物工程（大連）有限公司）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存。

1.4.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝HSP70基因序列（序列號(hào)：EU680475）和GAPDH 基因序列（序列號(hào)：DQ821717），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，HSP70 F：5′-GGAGACAAGTCCGAGAAT-3′，HSP70 R：5′-GGAGGGATGCCTGTTAGA-3′；GAPDHF：5′-GGTGGTGCTAAGCGTGTCAT-3′，GAPDH-R：5′-CCCTCCACAATGCCAAAGTT-3′。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 熒光實(shí)時(shí)定量PCR在美國(guó)產(chǎn)ABI7000 熒光定量分析儀上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)液配比為：cDNA模板1.0 μL，上游引物、下游引物各0.4 μL，PremixEx Taq10 μL，滅菌蒸餾水7.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL。反應(yīng)條件是：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。所有樣品檢測(cè)均設(shè)1 個(gè)平行樣和1 個(gè)無(wú)模板的陰性對(duì)照以排除假陽(yáng)性結(jié)果。獲得HSP70 標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=-3.5846Log（X）+27.2794，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9693；內(nèi)參GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=-3.5086Log（X）+23.8604，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9679。△Ct（CtHsp70-CtGAPDH）與模板倍比稀釋濃度的線(xiàn)性方程為：Y=0.018X+3.406，斜率接近0，說(shuō)明HSP70 mRNA和內(nèi)參GAPDH 具有相似的擴(kuò)增效率，可以應(yīng)用2-△△Ct法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)試驗(yàn)所獲得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析和duncan′s 多重比較，數(shù)值以±SD的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 急性熱應(yīng)激對(duì)仔鵝血清幾種激素水平的影響 如表1 所示，2 h 熱應(yīng)激處理并未對(duì)血清INS水平造成顯著影響；從熱應(yīng)激4 h 開(kāi)始，鵝血清INS水平顯著下降（P＜0.05），此后隨熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)未再出現(xiàn)顯著變化。仔鵝血清COR 濃度從熱應(yīng)激4 h 后開(kāi)始顯著性升高（P＜0.05），但熱應(yīng)激處理4、6、8 h 和10 h 之間無(wú)顯著差異。仔鵝血清T3濃度在熱應(yīng)激處理2 h 以后極顯著下降（P＜0.01），熱應(yīng)激6 h 和8 h 后降至最低水平。血清T4水平在熱應(yīng)激2 h 后便顯著下降，但到熱應(yīng)激10 h后又恢復(fù)到對(duì)照組水平。

表1 急性熱應(yīng)激條件下仔鵝的血清激素水平

2.2 急性熱應(yīng)激對(duì)仔鵝肝臟HSP70 mRNA水平的影響 如圖1 所示，仔鵝肝臟HSP70 mRNA水平從熱應(yīng)激2 h 后便開(kāi)始顯著升高，其中熱應(yīng)激2、8 h 和10 h 處理組HSP 70 mRNA表達(dá)水平相近，均顯著低于熱應(yīng)激4 h 和6 h 組，上述差異均達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 H SP70mR NA在熱應(yīng)激處理仔鵝肝臟內(nèi)的表達(dá)水平

3 討論

3.1 急性熱應(yīng)激對(duì)鵝血清激素水平的影響 熱應(yīng)激狀態(tài)下，交感神經(jīng)興奮，腎上腺素和去甲腎上腺素分泌增多，進(jìn)而抑制胰島素的分泌[4]。本試驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)了這一論點(diǎn)，急性熱應(yīng)激4 h 可顯著降低仔鵝血清INS水平，但此后再進(jìn)一步延長(zhǎng)熱應(yīng)激時(shí)間并未引起INS水平進(jìn)一步降低。肉雞熱應(yīng)激方面的研究也得出了相似結(jié)論，在短期熱應(yīng)激過(guò)程中胰島素下降，而在長(zhǎng)期應(yīng)激過(guò)程中胰島素水平呈無(wú)規(guī)律變化[5]。許多研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激可顯著提高動(dòng)物機(jī)體COR 水平[6]。本試驗(yàn)得出相同結(jié)論，仔鵝血清COR 濃度在熱應(yīng)激4 h 開(kāi)始顯著升高，但隨時(shí)間推移，皮質(zhì)醇含量沒(méi)有進(jìn)一步提高。由于本試驗(yàn)僅進(jìn)行10 h 急性熱應(yīng)激處理，10 h 后鵝血清COR的變化需進(jìn)一步研究證實(shí)。

高溫環(huán)境中，雞通過(guò)減少甲狀腺激素分泌降低自身代謝產(chǎn)熱[7]。T3濃度在熱應(yīng)激條件下會(huì)迅速下降，為肉雞熱應(yīng)激敏感指標(biāo)；T4受熱應(yīng)激后也下降，但反應(yīng)較T3遲緩，可作為熱應(yīng)激的參考指標(biāo)[8-9]。本研究中，仔鵝甲狀腺功能對(duì)熱應(yīng)激也表現(xiàn)出了較高的敏感性，T3、T4水平均在熱應(yīng)激2 h 后便顯著下降，進(jìn)而降低代謝水平，減少體產(chǎn)熱以維持體熱平衡。但也有研究提出了相反的結(jié)論[10]。

3.2 急性熱應(yīng)激對(duì)仔鵝肝臟HSP70 mRNA水平的影響 本試驗(yàn)熱應(yīng)激處理2 h，仔鵝肝臟HSP70 mRNA表達(dá)量極顯著升高，比應(yīng)激前上升3.57 倍，與許友生（2011）[11]研究結(jié)果一致。而王德前（2012）[12]認(rèn)為，熱應(yīng)激對(duì)蛋鴨肝臟中HSP70 mRNA的表達(dá)量沒(méi)有影響。這可能與動(dòng)物品種、熱應(yīng)激的強(qiáng)度和時(shí)間等因素有關(guān)。同時(shí)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝臟HSP70 mRNA水平6 h 升至最高點(diǎn)，8、10 h 低于6 h 水平，這可能因?yàn)镠SP70 的表達(dá)受到負(fù)反饋調(diào)控，即高含量的HSP70與HSF結(jié)合并抑制HSF的活性，從而減少HSF和HSE的特異性結(jié)合，控制熱休克基因的進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄，也可能由于機(jī)體進(jìn)行自我保護(hù)性的調(diào)節(jié)反應(yīng)，使機(jī)體逐步適應(yīng)了環(huán)境的變化。

4 結(jié)論

（40±1）℃不同時(shí)間長(zhǎng)度的急性熱應(yīng)激處理導(dǎo)致仔鵝生理機(jī)能的顯著變化，血清COR含量顯著上升，INS、T3、T4含量顯著下降；熱應(yīng)激下HSP70 基因的表達(dá)受熱應(yīng)激調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)表達(dá)的HSP70 使機(jī)體獲得了一定的高溫耐受力，對(duì)應(yīng)激起到一定的保護(hù)作用。

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