張素輝，付利芝，黃勇富，沈克飛

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌402460 ；2.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460；3.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北碚 400716）

化膿隱秘桿菌,原稱化膿棒狀桿菌（Corynebacterium pyogenes）、化膿放線菌（Actinomyces pyogenes），1997 年定名為化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes），根據(jù)其16SrRNA的基因序列的分析結(jié)果，將其歸入隱秘桿菌屬更為恰當(dāng)[1]。該菌最早（1893）從牛的膿汁中分離到，為條件性致病菌[2]；可在家畜間廣泛傳播，是一種對(duì)反芻家畜和豬非常重要的共生條件性致病菌。當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)，如運(yùn)輸、寒冷、斷奶及其他異常條件刺激時(shí)，致使機(jī)體抵抗力下降，體內(nèi)的化膿隱秘桿菌或已處隱性感染情況下的化膿隱秘桿菌大量增殖，加強(qiáng)致病作用而引起發(fā)病或惡化[3-4]。常導(dǎo)致廣泛多樣的皮膚、內(nèi)臟器官和關(guān)節(jié)的非特異性化膿性感染，如牛、羊、豬乳房炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肝膿腫、子宮炎以及流產(chǎn)等病理變化，嚴(yán)重時(shí)，常因膿毒敗血癥而死亡。已證實(shí)化膿隱秘桿菌是牛呼吸道疾病綜合征重要的細(xì)菌性病原之一[5]。

在重慶地區(qū)未見有關(guān)于化膿隱秘桿菌對(duì)羊只危害的相關(guān)報(bào)道，本研究從羊只病變的肝臟、肺臟和心血組織中成功培養(yǎng)并純化出化膿隱秘桿菌，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定分析，為進(jìn)一步研究其致病機(jī)理、診斷技術(shù)和疾病控制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 20 日齡左右的小鼠，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑 小牛血清、PCR反應(yīng)試劑2×TaqPCR Master Mix、DNA抽提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；青霉素等28種藥敏紙片，購(gòu)自上海衛(wèi)生技術(shù)服務(wù)公司；細(xì)菌16SrRNA引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成；引物序列為：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTAC-GACTT-3′[6]。

1.3 病原菌的分離純化 對(duì)病死羊只的肺臟、肝臟病變部位和心血組織進(jìn)行無菌劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和小牛血清瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～96 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，并將分離到的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4 生化特性鑒定及致病性試驗(yàn) 將分離菌接種肉湯培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)72 h 后接種微量生化反應(yīng)管，于37 ℃培養(yǎng)24～48 h 觀察分離菌生化特性。同時(shí)取菌液調(diào)整濃度至1×109CFU/mL，經(jīng)腹腔注射0.2 mL/只菌懸液3 只；設(shè)生理鹽水對(duì)照2 只及空白對(duì)照1 只。連續(xù)7 d 觀察小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況及臨床癥狀，并對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)及病原鑒定。

1.5 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片法做藥敏試驗(yàn)。檢測(cè)該菌對(duì)氨芐青霉素等28 種抗生素的敏感性，抑菌圈直徑＜10 mm表示其對(duì)抗生素具有一定的耐藥性，10～15 mm的為中度敏感，＞15 mm 的為高度敏感。

1.6 病原菌16SrRNA的PCR 擴(kuò)增測(cè)序 參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.7 系統(tǒng)進(jìn)化分析 病原菌的16SrRNA序列測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast 比對(duì)后，借助MEGA軟件，利用Neighbor-Joining 方法將所得序列與GenBank 中已知相關(guān)性較高菌株的16SrRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，各代表菌株相關(guān)信息如表1，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

表1 系統(tǒng)發(fā)育樹的代表菌株及16SrDNA序列信息

2 結(jié)果

2.1 病原菌對(duì)山羊組織病變的影響 感染了該病原菌的羊只肝臟和肺臟出現(xiàn)了不同程度的出血癥狀，胸腔黏膜表面局部有化膿灶。見中插彩版圖1 所示。

2.2 病原菌的形態(tài)特征 分離菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求較高，在普通瓊脂平板上生長(zhǎng)十分緩慢，培養(yǎng)72 h 后仍觀察不到菌落；在小牛血清瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后，可觀察到直徑大小約1.0 mm 黏性菌落。挑取單個(gè)菌落于小牛血清肉湯37 ℃振蕩培養(yǎng)72 h 后革蘭染色鏡檢，鏡檢結(jié)果見中插彩版圖2，為細(xì)小的革蘭陽(yáng)性菌，菌體呈球狀、桿狀、絲狀等多形態(tài)。

2.3 分離菌生化鑒定及致病性試驗(yàn) 生化鑒定結(jié)果顯示，該分離菌能夠利用葡萄糖、乳糖、淀粉等物質(zhì)，能夠液化明膠，而不能利用棉籽糖、山梨醇、尿素等。3只小鼠在接種了病原菌24 h后，均出現(xiàn)精神委靡，反應(yīng)遲鈍的癥狀，120 h 后2 只死亡，第3 只在接種7 d后死亡，正常對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)狀況良好。死亡小鼠肝臟和肺臟明顯出血，肝臟表面有化膿灶；腹腔布滿化膿液，腸道嚴(yán)重液化。見中插彩版圖3 所示。

2.4 藥敏試驗(yàn) 該分離菌對(duì)氨芐西林、氟苯尼考、丙氟哌酸、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、奧復(fù)星、利福平、阿奇霉素、新霉素、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢呋辛、諾氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、先鋒必、淋必治、痢特靈敏感，對(duì)甲氧芐啶、四環(huán)素、紅霉素、潔霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、克林霉素、乙酰螺旋霉素均表現(xiàn)出明顯的耐藥性。

2.5 病原菌16SrRNA序列的擴(kuò)增與分析 將測(cè)序后的分離菌16SrRNA基因序列登錄到GenBank，登錄號(hào)為KJ842125。同時(shí)在GenBank 進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes，登陸編號(hào)為HQ712123）同源性高達(dá)98%；在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹種也與其聚為一簇，且自展值為99，可信度較高，進(jìn)化樹結(jié)果如圖4 所示。

圖4 基于16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹狀圖

3 討論

化膿隱秘桿菌是一種條件致病菌，對(duì)不同的宿主可能造成不同程度的病理變化，其危害機(jī)體可能與多種毒力因子有關(guān)，目前，報(bào)道最多的主要有化膿隱秘桿菌溶血素（PLO）、膠原結(jié)合蛋白（CbpA）、神經(jīng)氨酸酶（Nan）和菌毛結(jié)合蛋白（Fim）等4 類，這些毒力因子主要影響動(dòng)物機(jī)體的紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞、功能蛋白等功能的發(fā)揮，從而降低機(jī)體免疫力，破壞免疫屏障，而常引起不同病原菌的混合感染[8-9]。

目前，關(guān)于化膿隱秘桿菌報(bào)道最多的是其對(duì)牛和豬的危害，其對(duì)羊的致病性研究相對(duì)較少，本研究利用細(xì)菌常規(guī)分離鑒定的方法，將臨床病原菌的分離鑒定與分子生物學(xué)診斷技術(shù)相結(jié)合，從山羊的病變組織中成功分離到了化膿隱秘桿菌，毒性試驗(yàn)表明，其對(duì)小鼠有較強(qiáng)的致病性，化膿性病變較為明顯[10-11]。以上研究為進(jìn)一步探討其毒力因子的作用機(jī)理和致病性奠定了基礎(chǔ)，也為研究由化膿隱秘桿菌引起的山羊感染性疾病的防治措施提供了理論依據(jù)[12]。

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