傅安靜，黃名英，高 艷，文 紅

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都611130 ；2.西南民族大學(xué)，四川 成都610041 ；3.成都溫江區(qū)農(nóng)法局動(dòng)物檢疫疾病控制中心，四川 成都 611130）

新城疫病毒（NDV）、高致病性禽流感病毒（AIV）、禽白血病病毒（ALV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)。利用雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）探討病毒與宿主相互作用的機(jī)制，對(duì)研究病毒感染及宿主抗病機(jī)理有重要意義。β連環(huán)蛋白（β-catenin）是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵參與者，Wnt/βcatenin 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖分化、人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都有重要作用[1]。而有關(guān)病毒感染與Wnt/β-catenin 信號(hào)之間關(guān)系的研究多集中于丙型肝炎病毒（HCV）、人類(lèi)皰疹病毒4 型(EBV)等致瘤性慢病毒，通過(guò)多種機(jī)制增加β-catenin 積累，激活其信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變及病毒感染伴隨的癌癥的發(fā)生[2-4]。ALV、REV感染后對(duì)β-catenin 表達(dá)的影響是否與人致瘤病毒相似；NDV、AIV感染后對(duì)βcatenin 表達(dá)的影響又如何，都未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)這4 種病毒感染CEF 后β-catenin mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，為探討這幾種病毒感染與機(jī)體的相互作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株和雞胚 新城疫強(qiáng)毒株F48E9（NDVF48E9），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；H5N1 亞型禽流感病毒（AIVH5N1）A/Duck/Guangdong/8/2001、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖癥病毒（REV）SD9901 和禽白血病病毒（ALV）NX0101，均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生及流行病學(xué)中心提供。SPF 雞胚，購(gòu)自青島易邦生物公司，由本實(shí)驗(yàn)室孵育至10 日齡后使用。

1.2 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7300（ABI公司，美國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000（Bio-Rad 公司，美國(guó)）；紫外分光光度計(jì)DU800（Beckman公司，美國(guó)）；高速冷凍離心（Eppendorf 公司，德國(guó)）。

1.3 主要試劑 SYBR?Premix ExTaqTM，購(gòu)自日本TaKaRa 公司；TRIZol Reagent，購(gòu)自Invitrogen 公司；RT-PCR 試劑盒，購(gòu)自博瑞克公司；DMEM/high 培養(yǎng)基、0.25%胰酶、小牛血清，均購(gòu)自Hyclone 公司。

1.4 病毒感染CEF和采樣 按文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行CEF的培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，繼一代至24 孔板上，每孔接5×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞在24孔板上長(zhǎng)成單層后，分別接100 個(gè)TCID50（組織細(xì)胞半數(shù)感染量）的病毒NDVF48E9、AIVH5N1、ALV和REV，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，對(duì)照組加同樣體積的Hank′s 液。NDVF48E9 和AIVH5N1 37 ℃感作30 min，ALV和REV感作60 min，添加含2%小牛血清的DMEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。NDVF48E9 和AIVH5N1 在接毒后3、6、9、12、24 h，ALV和REV在接毒后24 h、3、5、7 d 和8 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)接毒組和對(duì)照組都設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，加TRIZol 收集細(xì)胞，細(xì)胞于-80 ℃保存。

1.5 RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)與cDNA的合成 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的提取，電泳檢測(cè)其完整性以及通過(guò)核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)OD260/280的比值和RNA的濃度。cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 β-catenin mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 參考本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化篩選的內(nèi)參基因，以核糖體蛋白亞基4（RPL4）作為內(nèi)參基因。用Rrt-PCR方法對(duì)樣本中β-catenin mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，引物序列為PF：5′-TGCTACAGCCGTTTCTAAT-3′，PR：5′-GCTACAATAACTTTGGGATAA-3′，反應(yīng)體系為：SYBR Green I 10 μL，ROX 0.4 μL，PF、PR 各0.5 μL，cDNA2 μL，去離子水6.6 μL，共20 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。對(duì)細(xì)胞樣品中β-catenin mRNA的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量[6]，同時(shí)用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以對(duì)照組細(xì)胞的β-catenin mRNA表達(dá)量為“1”，接毒組是對(duì)照組的倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 病毒感染后細(xì)胞病變情況及病毒的Rrt-PCR檢測(cè)結(jié)果 NDVF48E9 接毒組細(xì)胞9 h 開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，24 h 時(shí)細(xì)胞病變達(dá)到60%，30 h 時(shí)細(xì)胞病變達(dá)到90%；AIVH5N1 接毒組細(xì)胞12 h 時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，24 h 時(shí)細(xì)胞病變達(dá)到40%，30 h時(shí)細(xì)胞病變達(dá)到80%；ALV和REV接毒組細(xì)胞無(wú)細(xì)胞病變和死亡，但是ALV和REV都是在感染CEF 后7 d 檢測(cè)到病毒；對(duì)照組無(wú)細(xì)胞病變和死亡，說(shuō)明4 種病毒成功感染CEF。接毒后的細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。

2.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 RNA樣本的電泳檢測(cè)見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示，3 條帶分別為5 SrRNA、18 SrRNA、28 SrRNA；所有RNA樣本的核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)OD260/280比值都在1.8～2.0 之間。說(shuō)明所提取的RNA符合要求。

2.3 4 種禽源病毒感染后β-catenin mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)

2.3.1 AIVH5N1 感染后β-catenin mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá) AIVH5N1 感染CEF 后β-catenin mRNA的表達(dá)水平如圖3 所示。結(jié)果顯示，AIVH5N1 感染后3h 誘導(dǎo)β-catenin mRNA的表達(dá)，接毒組是對(duì)照組的3.14 倍，差異極顯著（P＜0.01）；接毒后6 h 時(shí)略高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.12 倍，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨后β-catenin mRNA的表達(dá)水平降低，接毒后9、12、24 h 時(shí)接毒組分別是對(duì)照組的0.5、0.03、0.3 倍，其中12 h 時(shí)差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 接毒后各組細(xì)胞形態(tài)

圖2 R NA電泳結(jié)果

圖3 AIV感染CEF 后β-cateninmR NA的表達(dá)量比對(duì)照組

2.3.2 NDVF48E9 感染后β-catenin mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá) NDVF48E9 感染CEF 后β-catenin mRNA的表達(dá)水平如圖4 所示。結(jié)果顯示，NDVF48E9 感染后3 h 誘導(dǎo)β-catenin mRNA的表達(dá)，接毒組是對(duì)照組的1.55 倍，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨后，接毒組細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)水平降低，感染后6、9、12、24 h 接毒組β-catenin mRNA表達(dá)水平分別是對(duì)照組的0.84、0.22、0.53、0.25 倍，其中接毒后9、24 h 時(shí)差異顯著（P＜0.05）。

圖4 NDV感染CEF 后β-cateninmRNA的表達(dá)量比對(duì)照組

2.3.3 ALV感染后β-catenin mRNA的 動(dòng)態(tài) 表達(dá)ALV感染CEF 后β-catenin mRNA的表達(dá)水平如圖5所示。結(jié)果顯示，ALV感染后24 h，接毒組β-catenin mRNA的表達(dá)水平略低于對(duì)照組，是對(duì)照組的0.82倍，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨后誘導(dǎo)β-catenin mRNA的表達(dá)，接毒后3、5、7、8 d時(shí)，接毒組細(xì)胞β-catenin mRNA的表達(dá)水平分別是對(duì)照組的6.20、3.11、6.70、2.21倍，其中3、7 d 時(shí)差異極顯著（P＜0.01），5 d 時(shí)差異顯著（P＜0.05）。

2.3.4 REV感染后β-catenin mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)

圖5 ALV感染CEF 后β-cateninmR NA的表達(dá)量比對(duì)照組

REV感染CEF 后β-catenin mRNA的表達(dá)水平如圖6 所示。結(jié)果顯示，REV感染后誘導(dǎo)β-catenin mRNA的表達(dá)，接毒后24 h、3、5、7、8 d 接毒組βcatenin mRNA的表達(dá)水平分別是對(duì)照組的2.38、2.71、2.05、2.64、2.80 倍，差異均顯著（P＜0.05）。

圖6 R EV感染CEF 后β-cateninmR NA的表達(dá)量比對(duì)照組

3 討論與小結(jié)

4 種禽源病毒感染后對(duì)CEF 內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)的影響 本研究顯示，β-catenin 參與NDV、AIV、REV和ALV的感染應(yīng)答，但表達(dá)模式不同：NDV、AIV感染初期都誘導(dǎo)β-catenin mRNA的表達(dá)，感染中、后期抑制β-catenin mRNA的表達(dá)；REV和ALV感染后均誘導(dǎo)β-catenin mRNA的表達(dá)。

一些病毒的體內(nèi)或體外感染研究中，感染后抑制機(jī)體β-catenin 表達(dá)的報(bào)道很少見(jiàn)。GSK-3β是β-catenin 降解復(fù)合體的重要成員之一，是βcatenin 的負(fù)調(diào)節(jié)物，該酶激活會(huì)抑制β-catenin 的積累[7]。Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游的效應(yīng)物TCF-4 可能與HIV形成多蛋白復(fù)合體，導(dǎo)致HIV轉(zhuǎn)錄的抑制，而通過(guò)轉(zhuǎn)染顯性負(fù)相突變體阻斷TCF-4 或β-catenin 的活性，則又增強(qiáng)HIV的復(fù)制[8]。這些有關(guān)HIV的資料表明，病毒感染后有可能通過(guò)一些機(jī)制抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)而致病，或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或增強(qiáng)病毒復(fù)制。NDV感染后能引起宿主細(xì)胞凋亡，而研究表明，NDV引起的細(xì)胞病變效應(yīng)是由凋亡引起的[9-10]。AIVH5N1 感染也會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）、人氣管上皮細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、MDCK 細(xì)胞等，研究表明，H5N1 亞型AIV導(dǎo)致哺乳動(dòng)物氣管上皮細(xì)胞死亡是由于細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)[11-13]。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞凋亡[14]，這就提示了Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在NDV、AIV感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引發(fā)細(xì)胞病變死亡中發(fā)揮作用的可能性。

REV和ALV感染CEF 后持續(xù)誘導(dǎo)β-catenin mRNA的表達(dá)，這與一些人類(lèi)致瘤性病毒感染后βcatenin 的表達(dá)模式相似。丙型肝炎病毒（HCV）的非結(jié)構(gòu)蛋白5A（NS5A）可通過(guò)激活PI3K 和Akt 激酶而刺激GSK-3β的磷酸化，使其失活，導(dǎo)致β-catenin的積累和β-catenin 依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)；或者可能單獨(dú)與p85形成復(fù)合體，與β-catenin 直接作用，激活βcatenin 信號(hào)[8-9]。EBV的潛伏膜蛋白（LMP）同樣可通過(guò)一些途徑激活β-catenin 信號(hào)，導(dǎo)致β-catenin 的高表達(dá)和積累，成為其致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變和腫瘤產(chǎn)生的誘因[4]。REV和ALV都是致瘤性慢病毒，其感染后β-catenin mRNA的表達(dá)模式與人類(lèi)致瘤病毒相似，由此可推測(cè)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可能也在REV和ALV的致病中發(fā)揮了重要作用。

這4 種病毒感染后通過(guò)何種蛋白成分、何種途徑影響Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，作用如何都有待研究，但上述結(jié)果為進(jìn)一步研究病毒感染致病與機(jī)體相互作用的分子機(jī)制提供了有價(jià)值的參考。

[1]Nusse R.Wnt signaling in disease and in development[J].Cell Res，2005，15（1）：28-32 .

[2]Milward A，Mankouri J，Harris M.Hepatitis Cvirus NS5Aprotein interacts with beta-catenin and stimulates its transcriptional activity in a phosphoinositide-3 kinase-dependent fashion[J].JGen Virol，2010，91（2）：373-381.

[3]Park CY，Choi SH，Kang SM，et al.Nonstructural 5Aprotein activates beta-catenin signaling cascades:implication of hepatitis Cvirus-induced liver pathogenesis[J].JHepatol，2009，51（5）：853-864.

[4]Tomita M，Dewan MZ，Yamamoto N，et al.Epstein-Barr virusencoded latent membrane protein 1 activates beta-catenin signaling in Blymphocytes[J].2009，100（5）：807-812

[5]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2 版.北京：科學(xué)出版社，1997：223-224.

[6]Vandesompele J，De Preter K，Pattyn F，et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol，2002，3（03）：43.

[7]吳桐，龐小穎，張浩.Wnt 信號(hào)途徑的分子機(jī)制[J].食品與藥品，2006，8（7）：5-8.

[8]Kumar A，Zloza A，Moon R T，et al.Active beta-catenin signaling is an inhibitory pathway for human immunodeficiency virus replication in peripheral blood mononuclear cells[J].JVirol，2008，82（6）：2813-2820.

[9]Ravindra P V，Tiwari AK，Sharma B，et al.HN protein of Newcastle disease virus causes apoptosis in chicken embryo fibroblast cells[J]，Arch Virol，2008，153：749-754.

[10]Ravindra P V，Tiwari AK，Ratta B，et al.Newcastle disease virus-induced cytopathic effect in infected cells is caused by apoptosis[J].Virus Research，2009，141：13-20.

[11]Ueda M，Daidoji T，Du A，et al.Highly pathogenic H5N1 avian influenza virus induces extracellular Ca2+influx,leading to apoptosis in avian cells[J].JVirol，2010，84（6）：3068-3078.

[12]Lam WY，Tang JW，Yeung AC，et al.Avian influenza virus A/HK/483/97（H5N1）NS1 protein induces apoptosis in human air-way epithelial cells[J].JVirol，2008，82（6）：2741-2751.

[13]Yng W，Qu S，Liu Q，et al.Avian influenza virus A/chicken/Hubei/489/2004（H5N1）induces caspase-dependent apoptosis in a cell-specific manner[J].Mol Cell Biochem，2009，332（1-2）：233-241.

[14]韓琳，馮新港.Wnt 信號(hào)通路及其在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用[J].中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)病，2008，16（3）：47-52.