翟海華 ，王 娟，蓋文燕，黃秀梅，曲志娜，王君瑋，常維山

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安271018 ；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032）

空腸彎曲桿菌是全球范圍內(nèi)引起人類腹瀉的主要細(xì)菌性病原菌之一，是一種人獸共患病病原菌。空腸彎曲桿菌可在多種家禽、家畜和野生動(dòng)物的腸道內(nèi)定植，特別是禽類，所以這些動(dòng)物都是潛在的感染源，家禽被認(rèn)為是感染人類的最主要的來(lái)源[1]。被污染的食物和水以及與動(dòng)物的直接接觸都是傳播空腸彎曲桿菌的主要途徑?？漳c彎曲桿菌的致病機(jī)制包括粘附、趨化、定植、侵襲,產(chǎn)生毒素以及與致病相關(guān)的分泌蛋白等，雖然人們對(duì)本菌的發(fā)病機(jī)制還并不明確,但研究證實(shí)毒力基因是主要的致病因素。為了解膠東半島地區(qū)空腸彎曲桿菌的分布、毒力因子的流行情況，本試驗(yàn)對(duì)膠東半島地區(qū)不同來(lái)源的禽源空腸彎曲桿菌進(jìn)行了分離鑒定，并選擇了與上述致病機(jī)制相關(guān)的14 種毒力基因，合成了相應(yīng)的引物，進(jìn)行毒力基因的檢測(cè)，為分析菌株之間的差異以及細(xì)菌可能的致病力提供了線索。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及主要試劑 Cary-Blair 氏運(yùn)送培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司），空腸彎曲桿菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)以及配套試劑（Sigma 公司，哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（OXOID公司）；2×TaqPCR Master Mix（Promega 公司），DNAMarker DL-2 000[TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司]；新鮮綿羊血，氧化酶試紙，3%過(guò)氧化氫酶試劑，1%馬尿酸鈉，茚三酮（青島海博生物科技公司）；API Campy Kit（法國(guó)生物梅里埃公司）。

1.2 樣品來(lái)源 共238 份樣品，均來(lái)自膠東半島地區(qū)。其中2 個(gè)市場(chǎng)上出售活雞的泄殖腔拭子20份，2 家大型禽屠宰場(chǎng)雞盲腸樣品66 份，3 家養(yǎng)雞場(chǎng)泄殖腔拭子152 份。

1.3 試驗(yàn)菌株 空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC3 3560），結(jié)腸彎曲菌，大腸桿菌，鼠傷寒沙門菌，金黃色葡萄球菌，糞腸球菌，阪崎腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)室保存。

1.4 樣品采集與運(yùn)送 養(yǎng)雞場(chǎng)和活禽市場(chǎng)：采集被檢雞的泄殖腔拭子，共采集泄殖腔拭子樣品172 份。屠宰場(chǎng)：屠宰線上采集雞盲腸段,共采集盲腸樣品66 份。所有樣品采集后均置于備有冰袋的泡沫盒中盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.5 細(xì)菌分離與鑒定

1.5.1 細(xì)菌分離與純化 泄殖腔拭子直接劃線接種于空腸彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基。對(duì)盲腸樣用接種環(huán)勾取少量盲腸盲端內(nèi)容物，劃線接種于空腸彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基上。將劃好的培養(yǎng)基放入?yún)捬跖囵B(yǎng)盒內(nèi),加上微需氧產(chǎn)氣袋,密封后42 ℃培養(yǎng)36～48 h。挑取疑似菌落接種于哥倫比亞血平板進(jìn)行純化，純化2～3 代，對(duì)純化好的菌株進(jìn)行血清保存。

1.5.2 模板制備 采用煮沸法提取模板：用接種環(huán)挑取哥倫比亞培養(yǎng)基上的適量菌落于500 μL滅菌的蒸餾水中,渦旋混勻，12 000 r/min 離心5 min，移去上清；再加入200 μL 滅菌水，吹打混勻，放入100 ℃水浴鍋內(nèi)作用10 min；取出立即冰浴5～10 min，12 000 r/min 離心5～10min,取上清于新的1.5 mL 離心管中，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.5.3 菌株初步鑒定 對(duì)可疑菌落進(jìn)行革蘭染色、氧化酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)和馬尿酸鈉水解試驗(yàn),按照GB/T 4789.9-2003 進(jìn)行菌株的鑒定。符合條件的菌株進(jìn)一步用API 試劑盒進(jìn)行空腸彎曲桿菌的鑒定，根據(jù)API 判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5.4 PCR鑒定 參照Van 等[2]的方法選擇16SrRNA基因設(shè)計(jì)合成引物，片段大小為733 bp。PCR反應(yīng)體系（25 μL）:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水9 μL。循環(huán)參數(shù)優(yōu)化為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。將PCR 產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖（0.5×TBE）進(jìn)行凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。試驗(yàn)以空腸彎曲桿菌ATCC33560為陽(yáng)性對(duì)照，其他非空腸彎曲桿菌為陰性對(duì)照。

1.6 毒力因子檢測(cè)

1.6.1 引物設(shè)計(jì) 基因cadF和cdtC引物根據(jù)Bang[3]等的試驗(yàn)方法，基因flaA和racR引物是根據(jù)薛峰[4]等介紹的方法，其他10種毒力基因引物是根據(jù)GenBank公布的基因序列設(shè)計(jì)的，引物序列、片段大小和退火溫度，見(jiàn)表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.6.2 毒力基因擴(kuò)增 經(jīng)PCR鑒定為空腸彎曲桿菌陽(yáng)性的模板,進(jìn)行相應(yīng)毒力基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL體系:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水9 μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s，43 ℃～56 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,置于凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并分析電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物膠回收后，采用PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)序。

表1 毒力基因PCR 引物

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

2.1.1 初步鑒定 在空腸彎曲桿菌選擇性培養(yǎng)基上可疑菌落呈灰白色或淺紅色，半透明，扁平濕潤(rùn)有光澤,有呈沿接種線向外擴(kuò)散的趨勢(shì)。革蘭染色為陰性，鏡檢呈逗點(diǎn)狀，若菌體相連，呈螺旋形或海鷗形。凡是鏡檢符合彎曲桿菌形態(tài)特征，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，馬尿酸鹽水解試驗(yàn)陽(yáng)性的可疑菌再進(jìn)行API 鑒定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判讀培養(yǎng)結(jié)果。

2.1.2 PCR 鑒定 利用所建立的方法,對(duì)分離到的可疑菌株進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果238 份采集的樣品中共分離到107 株空腸彎曲桿菌，分離率為45%，PCR 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 空腸彎曲桿菌PCR 檢測(cè)結(jié)果

表2 空腸彎曲菌分離結(jié)果

2.2 毒力基因檢測(cè)結(jié)果 14 種空腸彎曲桿菌毒力基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果見(jiàn)圖1，以空腸彎曲桿菌參考菌株作對(duì)照，并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)比對(duì)PCR 產(chǎn)物是目的基因產(chǎn)物?？漳c彎曲桿菌分離株各個(gè)毒力基因的檢出率如圖3 所示。針對(duì)所檢測(cè)的14 種毒力因子，107 株空彎分離株中有4 株含有全部14 種毒力因子，占總分離數(shù)的3.7%，39 株含有13 種毒力因子，占總數(shù)的36.4%，38 株含有12 種毒力因子，占總數(shù)的35.5%，23 株含有11 種毒力因子，占總數(shù)的21.5%，還有3 株含有10 種毒力因子，占總數(shù)的2.8%。

3 討論

娜仁高娃等[5]從700 多份新鮮雞糞樣品中共分離到空腸彎曲桿菌208 株，分離率為26.9%。陳荀等[6]從養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)雞糞樣品中分離率為74.29%和66.38%。本次試驗(yàn)對(duì)膠東半島地區(qū)市場(chǎng)、蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)和肉雞屠宰場(chǎng)的雞源空腸彎曲桿菌進(jìn)行分離鑒定，平均分離率為45%。

目前對(duì)于空腸彎曲桿菌的致病機(jī)理不是十分明確，但許多研究已經(jīng)證實(shí)毒力因子與細(xì)菌的毒力及致病能力相關(guān)。本試驗(yàn)中選擇了目前國(guó)內(nèi)外研究較多的14 種毒力相關(guān)基因，對(duì)膠東半島地區(qū)107 株空腸彎曲桿菌分離株毒力相關(guān)基因的存在情況進(jìn)行了調(diào)查分析。

圖2 空腸彎曲桿菌毒力基因PCR 檢測(cè)圖

鞭毛在空腸彎曲桿菌致病過(guò)程中起到提供動(dòng)力和粘附作用，鞭毛蛋白基因flaA是重要的毒力因子，粘附蛋白PEB1 是主要的粘附因子。本試驗(yàn)中flaA和peb1A的檢出率分別為100%和99.07%，與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道一致。pldA基因編碼一種外膜磷脂酶A，在病菌入侵細(xì)胞時(shí)起作用，磷脂酶還和溶血活性有關(guān)[7]。侵入抗原蛋白基因ciaB是空腸彎曲菌最大限度入侵組織細(xì)胞所必需侵入抗原蛋白，racR基因是racRracS系統(tǒng)的一員，編碼調(diào)節(jié)蛋白在彎曲桿菌定植禽類腸道時(shí)起作用，cadF 基因編碼外膜蛋白與纖連蛋白結(jié)合，介導(dǎo)空腸彎曲桿菌與宿主腸上皮細(xì)胞。本試驗(yàn)中pldA，ciaB，racR，cadF 的檢出率分別為100%，96.26%，97.20%和99.07%。細(xì)胞致死性膨脹毒素（CDT）基因cdtA，cdtB，cdtC的檢出率分別76.64%，100%和100%，在Hamidian[8]和張茂俊[9]等的研究中這3 種基因的檢出率都接近100%，而本結(jié)果cdtA的檢出率較低，原因需要進(jìn)一步研究。趨化因子cheW，cheY 的檢出率為99.07%，98.13%，高檢出率說(shuō)明趨化作用在空腸彎曲桿菌的致病過(guò)程中起到非常重要的作用。熱休克蛋白dnaK和grpE的檢出率為100%和71.96%。neuB1 基因決定了空腸彎曲桿菌LOS中唾液酸的合成與表達(dá)，本試驗(yàn)中neuB1 檢出率為4.67%。

圖3 107株空腸彎曲桿菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果

膠東半島地區(qū)雞源空腸彎曲桿菌毒力基因攜帶率較高，所分離到的菌株所攜帶的毒力基因數(shù)都超過(guò)10 種。感染宿主沒(méi)有臨床表現(xiàn)，可能本菌致病性與多種因素有關(guān)。菌株毒力基因高攜帶率說(shuō)明具有潛在致病力，如果人們接觸到被污染的沒(méi)有加工成熟的食品，很容易造成感染，應(yīng)加強(qiáng)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)的安全控制，保證食品安全。國(guó)內(nèi)對(duì)空腸彎曲桿菌毒力因子的研究報(bào)道還比較少，要加強(qiáng)空腸彎曲桿菌及其毒力基因的檢測(cè)，這對(duì)空腸彎曲桿菌病的防控具有重要意義。

[1]Griekspoor P，Colles F M，McCarthy N D，et al.Marked host specificity and lack of phylogeographic population structure of Campylobacter jejuni in wild birds[J].Molecular ecology，2013.22:1463-1472.

[2]Van de Giessen AW，Tilburg J，Ritmeester WS，et al.Reduction of Campylobacter infections in broiler flocks by application of hygiene measures[J].Epidemiology and infection，1998，121（01）:57-66.

[3]Bang DD，Nielsen E M，Scheutz F，et al.PCR detection of seven virulence and toxin genes of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates from Danish pigs and cattle and cytolethal distending toxin production of the isolates[J].Journal of applied microbiology，2003，94（6）:1003-1014.

[4]薛峰，徐飛，張小榮，等.空腸彎曲菌PCR-RAPD分子亞分型及其毒力相關(guān)基因分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18（3）:586-591.

[5]娜仁高娃，陳霞，吳聰明.雞源空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的臨床分離及多重PCR 鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（1）:38-39.

[6]陳荀，劉書(shū)亮，吳聰明，等.雞肉生產(chǎn)鏈中空腸彎曲桿菌的污染分析及PFGE 分型研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)ISTIC，2012，28（10）：1012-1016.

[7]Xuan Thanh Bui，Klaus Qvortrup，Anders Wolff，et al.Effect of environmental stress factors on the uptake and survival of Campylobacter jejuni in Acanthamoeba castellanii[J].BMCMicrobiology，2012，12：232.

[8]Hamidian M，Sanaei M，Bolfion M，et al.Prevalence of putative virulence markers in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from hospitalized children,rawchicken，and rawbeef in Tehran,Iran[J].Canadian journal of microbiology，2011，57（2）：143-148.

[9]張茂俊，顧一心，冉陸，等.空腸彎曲菌多重聚合酶鏈反應(yīng)基因鑒定及其毒力相關(guān)基因分析[J].中華流行病學(xué)雜志，2007，28（4）：377-380.