劉　磊，王安杏，王化杰，徐文斌，張　敏

糖化血紅蛋白檢測方法研究

劉磊，王安杏，王化杰，徐文斌，張敏

摘要:目的，血紅蛋白與葡萄糖通過非酶促反應形成糖化血紅蛋白，在醫(yī)學上糖化血紅蛋白的檢測作為診斷的重要指標。方法，葡萄糖常規(guī)分離血紅蛋白的方法很多，本文通過一種簡單、快速，分離糖化血紅蛋白的方法，等電聚焦分離檢測糖化血紅蛋白。結(jié)論，通過等電聚焦的方法對糖化血紅蛋白進行分離，根據(jù)朗伯-比爾定律，在一定范圍內(nèi)，蛋白濃度與光密度(OD)值呈線性關(guān)系，從而計算出糖化血紅蛋白的含量，本方法應用于糖化血紅蛋白的定量研究具有重要的意義。

關(guān)鍵詞:糖化血紅蛋白;等電聚焦;檢測

人類的血紅蛋白(Hemoglobin, Hb)是由血紅素(Heme)和珠蛋白(Globin)組成的球形大分子化合物。每個血紅蛋白分子含有4條珠蛋白肽鏈，每個肽鏈結(jié)合一個含有亞鐵血紅素，形成具有四級空間結(jié)構(gòu)的四聚體。人類珠蛋白肽鏈有兩大類，即α類鏈和非α類鏈，非α類鏈包括β、δ、ε等。不同血紅蛋白肽鏈的構(gòu)成也有差異。正常成年人的血紅蛋白主要由血紅蛋白HbA(α2β2)組成，其中HbA又可分為非糖化血紅蛋白HbA0和糖化血紅蛋白HbA1。其中 HbA1c是糖化血紅蛋白HbA1主要成分，是總糖化血紅蛋白GHb分子中最有特征性的成分[1]。

作為一種轉(zhuǎn)錄后的血紅蛋白，HbA1c與正常血紅蛋白的分離研究早在1958年開始。Huisman等利用羧甲基纖維素色譜柱，在研究蛋白種類時發(fā)現(xiàn)了一種有別于正常血紅蛋白的組分，并將其命名為HbA1c。1968年Bookchin等在對HbA1c的化學結(jié)構(gòu)研究中，發(fā)現(xiàn)這種蛋白的β鏈末端結(jié)合葡萄糖分子。1975年Bunn首次確定了這種組分就是色譜法中發(fā)現(xiàn)的HbA1c并且提出了人體內(nèi)生成HbA1c的非酶促反應途徑。次年Koenig和Cerami 首次發(fā)現(xiàn)HbA1c與糖尿病患者的血糖水平控制成正相關(guān)[2]，從此HbA1c作為了一種重要的標記物，應用于作為糖尿病的臨床診斷標準。

1糖化血紅蛋白的測量方法

1.1　GHb的檢測方法

GHb的測定方法有很多[3-4]，基本上可分為兩類：一類是根據(jù)血紅蛋白上糖化基團的結(jié)構(gòu)特點，如親和層析法、免疫法和酶法等；另一類是基于GHb和Hb的電荷不同，如離子交換層析法、電泳法。這些測量的方法各有優(yōu)缺點。根據(jù)各種糖化血紅蛋白所帶的電荷不同，本實驗以等電聚焦的方法為例，對血紅蛋白進行了初步分離。

毛細管電泳(Capillary Electrophoresis, CE)[5-6]，是非常重要的一種分離方法，在毛細管中，以高壓電場力為驅(qū)動力，根據(jù)每種分離物質(zhì)的等電點差異，較為高效、快速的分離技術(shù)(見圖1)。通過對毛細管及其填充物進行修飾或改進，可以分為電泳型、陣列式以及芯片式幾種不同的分離模式。根據(jù)毛細管填充物的不同，列出了四種電泳型的分離模式，其中毛細管等電聚焦電泳得到的蛋白區(qū)帶很窄，但蛋白的濃度較高，非常有利于糖化血紅蛋白的分離和檢測。

圖1　毛細管電泳裝置原理圖

1.2　基于CIEF的糖化血紅蛋白檢測

傳統(tǒng)毛細管等電聚焦電泳(CIEF)，將載體兩性電解質(zhì)、分離樣品等混合物注入毛細管內(nèi)，在兩端加上直流電壓時，兩性電解質(zhì)可以形成一定范圍的pH梯度，每種組分根據(jù)其等電點(PI)不同，等電點與pH梯度相同時，樣品停止運動，從而使各組分達到分離的目的。作為CIEF的核心部件，目前使用的常規(guī)毛細管，具有金屬雜質(zhì)含量低、吸附相對較小的優(yōu)點。由于管徑很小，在進行IEF分離時通過的電流值和隨之產(chǎn)生的焦耳熱也越小。使用內(nèi)徑極小的毛細管作為分離介質(zhì)，能夠較大提高熱的擴散效率，從而達到提高分離效率。因此CIEF可以獲得高分辨的，快速的蛋白質(zhì)分離。更重要的是相比常規(guī)的平板凝膠電泳，CIEF具有重要的優(yōu)點：分離效率提高，復雜樣品的分離過程時間短。這些優(yōu)點，在一定程度上也推動了糖尿病診斷中的臨床研究。

但毛細管電泳的主要缺點之一是分析通量太小，不能同時分離多個樣品，因此在常規(guī)分析應用中存在不足。陣列毛細管電泳因其速度快、通量大而在基因測序方面發(fā)揮了極大的作用。本實驗根據(jù)在毛細管中進行糖化血紅蛋白的分離(圖2)[7-8]，分離后的條帶進行全柱成像(圖3)[9-10]。

圖2　糖化蛋白的毛細管等電聚焦電泳示意圖

圖3　全柱掃描檢測及全柱成像檢測

2實驗步驟與結(jié)果

2.1　準備樣品

毛細管加入兩性電解質(zhì)及不同濃度的血紅蛋白，加壓分離。

測量前，將樣品放好，調(diào)整CMOS位置及透鏡組上下間距，保證樣品圖像水平且清晰；拿出樣品，取空白圖像做為對照；依次放置不同濃度的樣品，得到不同樣品的結(jié)果；

2.2　血紅蛋白條帶的OD值與相對位置Position之間的關(guān)系

光密度(optical density, OD)，定義為光線通過樣品前入射光強與該光線通過該樣品后透射光強比值的對數(shù)，即

(2-1)

公式(2-1)中OD為光密度，I0為入射光強度，I1為透射光強度。將空白圖像的灰度值作為初始光強I0，放上樣品后的光強作為I1，通過matlab數(shù)據(jù)處理軟件編程，可得圖像上所有象元的OD值與像素Pixel之間的關(guān)系。由圖3可以看出：OD值的基線水平大概在0～0.18之間，即蛋白條紋沒有聚焦的地方也存在吸收。除了毛細管之外的地方由公式可知為OD=0。其中有些地方OD>0，可能是毛細管內(nèi)外徑之間光線偏折帶來的影響。而毛細管內(nèi)部的蛋白條紋上下含量有差異，吸收情況也會不同，所以會呈階梯型上升狀態(tài)，其最大包絡線應為蛋白吸收最大的情況。

為精確表示蛋白條紋的吸收，取圖3.1中聚焦蛋白條紋灰度曲線最大44組數(shù)據(jù)作參考，做平均處理能有效去除探測器的噪聲使OD曲線相對比較平滑，并且根據(jù)象元尺寸換算可以得到OD值與相對位置Position之間的關(guān)系(單位：mm)：

Positon=0.0022×Pixel

(2-2)

圖4　OD值與位置Position之間的關(guān)系

2.3　血紅蛋白條紋的OD值與濃度之間的關(guān)系

根據(jù)朗伯-比爾定律可知，當一束波長為λ的平行光通過均勻的非散射的吸光樣品溶液后，光密度(吸光度)與樣品的長度和吸光物質(zhì)微粒數(shù)目(溶液的濃度)的乘積成正比，即

(2-3)

公式(2-3)中，λ為單色光的波長，K為比例常數(shù)，x為通過樣品的長度，c為樣品的濃度。在圖3.2中找到每一種蛋白濃度下，4種不同蛋白條紋的最大OD值，做4條蛋白條紋的OD值隨濃度的擬合曲線：由擬合曲線可看出，HbA1c與濃度的線性關(guān)系最好，擬合度為97.38%。這將對糖化血紅蛋白檢測提供參考。

圖5　OD值與濃度之間的關(guān)系

3結(jié)論

通過以上實驗，在毛細管中，對血紅蛋白進行了分離，分離的方法是等電聚焦，根據(jù)血紅蛋白的亞基不同，每種糖化的血紅蛋白所帶的等電點也不相同，從而實現(xiàn)分離，最后根據(jù)等電聚焦條帶的光密度不同，從而實現(xiàn)定量，從這個意義上來說，等電聚焦對血紅蛋白進行分離，然后進行定量，具有可行性。這將為以后的定量研究提供了參考。

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責任編輯：劉海濤

收稿日期：2015-01-13

作者簡介：劉磊，安徽職業(yè)技術(shù)學院教師，中國科技大學博士研究生，研究方向：生物化工分離技術(shù)；王安杏，王化杰，徐文斌，安徽職業(yè)技術(shù)學院(合肥 230011)；張敏，上?？圃措娮涌萍加邢薰?上海 201101)。

中圖分類號:R446.1

文獻標識碼：A

文章編號：1673-1794(2015)02-0047-04