謝欣梅，王　琳，趙　艷，陳若蕓，龐曉斌*，杜冠華*

(1. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開(kāi)封 475004；2. 青島市市立醫(yī)院 山東 青島 266011；3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 國(guó)家藥物篩選中心，北京 100050)

消栓通絡(luò)有效成分組對(duì)大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

謝欣梅1，王琳1，趙艷2，陳若蕓3，龐曉斌1*，杜冠華3*

(1. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開(kāi)封 475004；2. 青島市市立醫(yī)院 山東 青島 266011；3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 國(guó)家藥物篩選中心，北京 100050)

摘要：目的研究消栓通絡(luò)有效成分組(XECG)對(duì)大鼠腦缺血再灌注(I/R)損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組，模型組，尼莫地平對(duì)照組(4 mg·kg-1)，XECG高、中、低劑量組(200、100、50 mg·kg-1)。采用線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈(MCAO)建立大鼠腦缺血/再灌注(I/R)模型。缺血2 h，再灌注24 h后，HE染色觀察大鼠缺血側(cè)腦組織的病理變化；Western blot法檢測(cè)缺血側(cè)腦組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (Interleukin 1β，IL-1β)的表達(dá)。結(jié)果XECG能明顯改善缺血再灌注大鼠腦組織的病理變化，降低缺血側(cè)腦組織TNF-α、IL-1β的表達(dá)。結(jié)論XECG對(duì)腦缺血再灌注大鼠具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低TNF-α、IL-1β的表達(dá)，抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：XECG；腦缺血/再灌注；炎癥反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R743.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：號(hào)： 1672-7606(2015)01-0006-04

收稿日期：2014-09-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81273652)。

作者簡(jiǎn)介：謝欣梅(1973-)，女，內(nèi)蒙古烏蘭浩特人，碩士，講師，從事藥理學(xué)與藥效學(xué)評(píng)價(jià)的教學(xué)與科研工作。

通訊作者：*龐曉斌(1973-)，男，河南洛陽(yáng)人，博士，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究工作；杜冠華(1956-)，男，山東滕州人，研究員，博士生導(dǎo)師，從事藥物發(fā)現(xiàn)的理論和技術(shù)研究工作。

Abstract:ObjectiveTo observe the protective effect and mechanism of effective components group of Xiaoshuantongluo (XECG) on ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats.MethodsHealthy male adult Sprague Dawley rats were randomly divided into the sham operation group，the model group, the nimodipine (4 mg·kg-1) group, and high, middle and low dose XECG groups (200, 100, 50 mg·kg-1). Middle cerebral artery occlusion was adopted to establish the rat ischemia / reperfusion model. After ischemia for 120 min and reperfusion for 24 h，the pathological injury of the ischemia side was observed by HE staining. Expressions of tumor necrosis factor α(TNF-α), Interleukin 1β (IL-1β) were detected by western blotting technique. ResultsXECG could significantly improve the pathological changes of cortical penumbra brain tissues, Compared with the I/R model group, XECG could significantly inhibit expressions of TNF-α、IL-1β. Conclusion XECG has obviously protective effect on Sprague Dawley rats after cerebral ischemia and reperfusion, its mechanisms may be associated with inhibiting inflammatory，expression of TNF-α and IL-1β proteins.

Protective effects and mechanism of effective components group of Xiaoshuantongluo on cerebral ischemia injury in rats

XIE Xinmei1, WANG Lin1, ZHAO Yan2, CHEN Ruoyun3, PANG Xiaobin1*, DU Guanhua3*

(1.InstituteofPharmacy,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China；2.QingdaoMunicipalHospital,Qingdao,Shandong266011,China；3NationalCentreforPharmaceuticalScreening,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Key words: XECG; ischemia/reperfusion; Inflammation

中風(fēng)是一種急性腦血管疾病，大約80%以上的中風(fēng)是因腦血管栓塞所致的缺血引起，目前尚無(wú)有效治療藥物[1-3]。因此，尋找有效治療中風(fēng)的藥物具有重要意義。

消栓通絡(luò)方出自北京同仁堂傳統(tǒng)秘方，由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂共11味中藥根據(jù)中醫(yī)藥理論配伍而成，具有活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)之功效，在中風(fēng)病的防治中發(fā)揮了重要作用[4,5]。消栓通絡(luò)有效成分組 (the effective components group of Xiaoshuantongluo, XECG) 是從消栓通絡(luò)方中經(jīng)分離提取獲得的多種有效成分組合，具有抑制血栓形成，改善腦血流，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等功能[6,7]。缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)理眾多，炎癥反應(yīng)是腦缺血疾病發(fā)生發(fā)展的重要作用機(jī)制之一，在腦缺血及再灌注損傷過(guò)程中，炎癥細(xì)胞因子導(dǎo)致腦組織炎癥反應(yīng)[8-10]。另外，炎癥損傷機(jī)制又可繼發(fā)其他損傷機(jī)制，這些因素相互關(guān)聯(lián)，互為因果，最終導(dǎo)致了缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展，因此，對(duì)于炎癥反應(yīng)的防治在減輕腦損傷中有著極為重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈內(nèi)線栓法( middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立大鼠腦缺血再灌注(ischemia / reperfusion，I/R)模型[11,12]，通過(guò)觀察缺血區(qū)腦組織病理變化以及缺血再灌注后炎性介質(zhì)的表達(dá)，探討消栓通絡(luò)有效成分組對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量280～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào) SCXY(京) 2012-0007。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，室溫(25±2) ℃，相對(duì)濕度(55±5)%，燈光控制12 h晝夜交替。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有操作均符合中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的要求。

1.2　藥物與試劑

消栓通絡(luò)有效成分組(XECG)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所陳若蕓研究員提供)；尼莫地平片(山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào):100702)；兔抗鼠TNF-α抗體、兔抗鼠IL-1β抗體購(gòu)自Santa-Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體購(gòu)自美國(guó)Pierce Biotechnology公司；SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)研究所。

1.3　主要儀器

顯微鏡 SZX16型 (日本 Olympus 公司)；冰凍切片機(jī)(萊卡，德國(guó))；PowerGen 125型組織勻漿機(jī)(賽默飛世爾公司)；GS-15R離心機(jī)(Beckinan公司，美國(guó))。

2方法

2.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

成年健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注模型組、尼莫地平給藥組(4mg·kg-1)、XECG高、中、低劑量組(200，100，50 mg·kg-1)，每組 10只。各組分別于再灌注即刻灌胃給藥，假手術(shù)組與模型組分別給予等量生理鹽水。

2.2　大腦MCAO法建立大鼠腦缺血/再灌注(I /R )模型

SD大鼠術(shù)前12 h禁食，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。參照Longa等的大腦中動(dòng)脈線栓法，造成左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞。缺血2 h后，將栓線向外拉出至頸內(nèi)實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組只進(jìn)行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及導(dǎo)入線栓。

2.3　神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注24 h后進(jìn)行大鼠神經(jīng)行為學(xué)觀察。參照Longa等的5級(jí)4分制：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，爬行時(shí)出現(xiàn)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

2.4　組織病理切片的制備

大鼠于再灌注24 h 后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛(350 mg·kg-1) 腹腔麻醉，開(kāi)胸經(jīng)心臟灌流生理鹽水，然后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，將腦組織放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛繼續(xù)固定48 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋處理，自視交叉后行冠狀切片，層厚5 μm，常規(guī)HE染色。

2.5　Western blot檢測(cè)TNF-α、IL-1β 的表達(dá)

I/R手術(shù)24 h后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，冠狀切取前囟前1.0 mm至前囟后3.0 mm的腦組織，進(jìn)行勻漿。在冰上加蛋白裂解液裂解，然后在4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min，進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，TNF-α(1∶500)、IL-1β(1∶200)、一抗 4 ℃下孵育 24 h后 TBST 洗滌 3 次；二抗37 ℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光，暗室顯影，定影，對(duì)膠片進(jìn)行掃描與拍照并進(jìn)行分析。

2.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3結(jié)果

3.1　XECG對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)癥狀的影響

再灌注24 h，各組大鼠無(wú)死亡，模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損(P<0.01)，XECG給藥組和尼莫地平組可明顯減輕缺血再灌注造成的神經(jīng)功能損害，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)。見(jiàn)表1。

與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

3.2　XECG對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織病理學(xué)的影響

結(jié)果顯示，假手術(shù)組神經(jīng)元排列緊密，核仁清晰，結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)神經(jīng)元變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組可見(jiàn)細(xì)胞排列散亂，神經(jīng)元明顯腫脹，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、嵌塞。XECG各劑量組、尼莫地平組與模型組相比，神經(jīng)細(xì)胞排列趨于整齊，神經(jīng)元變性程度較輕，壞死灶明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，其中XECG中、高劑量組改善效果更明顯。見(jiàn)圖1。

3.3　XECG對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織TNF-α、IL-1β 表達(dá)的影響

腦缺血/再灌注24 h后，缺血區(qū)皮層組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)顯著增加，XECG于缺血后早期給藥對(duì)于TNF-α、IL-1β的表達(dá)均有不同程度的抑制作用。見(jiàn)圖2。

4討論

XECG是從消栓通絡(luò)方中分離獲得的多種有效成分組合制劑，研究表明XECG對(duì)血管系統(tǒng)和神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。本文通過(guò)制備大鼠腦缺血再灌注動(dòng)物模型，探討XECG對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，XECG可明顯減輕腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損害，顯著改善缺血側(cè)腦組織病理?yè)p傷，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有明顯保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，炎性細(xì)胞因子TNF-α、1L-1β在其中起到重要的作用[13]。在生理狀態(tài)下，炎性細(xì)胞因子只有低水平表達(dá)，而在缺血期間，炎癥因子的表達(dá)上調(diào)。炎性因子一方面通過(guò)刺激其它細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)損傷區(qū)白細(xì)胞浸潤(rùn)；另一方面可刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促進(jìn)白細(xì)胞在損傷區(qū)聚集，加劇微血管的閉塞、氧自由基的形成、細(xì)胞毒素酶的釋放、血管收縮反應(yīng)的改變等，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，加重缺血性腦損傷[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot法檢測(cè)缺血腦組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組腦組織TNF-、IL-1β 的表達(dá)比假手術(shù)組顯著升高，說(shuō)明腦缺血再灌注損傷后出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)加重了腦缺血損傷。與模型組相比，XECG各劑量組均能降低TNF-α、IL-1β 的表達(dá)，提示XECG對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，XECG對(duì)腦缺血再灌注后損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低TNF-α、IL-1β 的表達(dá)，抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

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[責(zé)任編輯段金卯]