李曉瑞蔣興旺張延平

·實驗研究·

C57BL／6J小鼠隨年齡增長耳蝸內毛細胞帶狀突觸數量變化的觀察△

李曉瑞1，2蔣興旺1張延平1

目的 探討C57BL／6J小鼠隨年齡增長耳蝸內毛細胞帶狀突觸（ribbon synapses，RS）的數量變化情況。方法 分別取2、6、10、12月齡C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜（每組5只），應用免疫組織化學染色方法對RS前、后膜進行雙重標記，激光共聚焦顯微鏡下定位成像，并應用三維重建技術對基底膜各段RS的數量進行計數。結果與2月齡小鼠相比較，6月齡C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜RS數量減少主要發(fā)生在底回，10月齡時各回RS數量均明顯減少，12月齡時頂回、中回RS數量繼續(xù)減少，底回反而有少許增多。結論 RS數量減少可能發(fā)生在C57BL／6J小鼠老年性聾的早期階段，探索阻止RS數量減少的治療措施可能成為早期干預老年性聾的重要途徑。

C57BL／6J小鼠； 內毛細胞； 帶狀突觸

C57BL／6J小鼠是一種具有先天性遺傳缺陷的老化型小鼠，其隨年齡增長的聽力學改變與臨床上老年性聾的表現相似，已成為目前研究老年性聾較為成熟的動物模型［1］。耳蝸內毛細胞帶狀突觸是聲信息傳遞到中樞的第一個傳入性的突觸結構，因其空間分布呈帶狀，故被稱為“帶狀突觸”（ribbon synapses，RS），在聲音的編碼和傳導過程中起著十分重要的作用［2］?，F有研究表明，各種因素如衰老、噪聲持續(xù)刺激、基因突變、耳毒性藥物等都會影響RS的形態(tài)結構和數量，引起不同程度的感音神經性聽力損失［3～5］。既往研究多利用超薄切片技術通過透射電鏡來觀察帶狀突觸的形態(tài)結構，為了進一步觀察年齡增長過程中帶狀突觸數量的動態(tài)變化，本研究聯合應用免疫熒光染色技術、激光共聚焦顯微鏡成像及三維重建技術，觀察C57BL／6J小鼠隨年齡增長耳蝸內毛細胞帶狀突觸數量的變化，為今后老年性聾發(fā)病機制的研究和預防提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 分別選取2、6、10、12月齡C57B L／6J小鼠（由北京大學醫(yī)學部動物實驗中心提供）各5只，雌雄不限，體重20～30 g，耳廓反射正常，均排除了中耳及內耳疾病。

1.2 實驗試劑 1%戊巴比妥鈉（解放軍309醫(yī)院動物研究中心提供）；山羊抗小鼠CtBp2抗體（美國SANTA CRUZ公司）；兔抗小鼠谷氨酸受體2／3抗體（美國CHEMICON公司）；FITC標記驢抗山羊抗體（美國Jackson公司）；TRITC標記驢抗兔二抗（美國Jackson公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 耳蝸基底膜制備 以1%戊巴比妥鈉按40 mg／kg行腹腔內注射麻醉小鼠后，將其固定于手術臺上，打開胸腔，細針穿刺心尖并以動脈血管夾固定，先用0.01 M PBS灌注置換血液，直至灌注液轉為無色，然后用4%多聚甲醛進行心臟灌注，固定標本。迅速斷頭去掉顳骨，取出雙側耳蝸，置于解剖顯微鏡下去除鐙骨，開放圓窗及卵圓窗，并用細針在蝸尖鉆孔，使頂回與底回之間形成通路，再用4%多聚甲醛緩沖液經直徑2 mm的塑料吸管緩緩自蝸尖向圓窗及卵圓窗進行灌流，置換出前庭階及骨階內的外淋巴，充分固定耳蝸內的組織和細胞。將完成灌注的耳蝸放置于4%多聚甲醛緩沖液中，室溫固定1.5小時或放置于4℃冰箱過夜。固定完成后取出耳蝸，置于0.01 M PBS中漂洗2次，再置于10% EDTA（p H＝7.4）液中浸泡1天進行脫鈣，直至細針能輕松穿刺入骨壁。將脫鈣滿意的耳蝸放置于0.01 M PBS中，解剖顯微鏡下從底回剝除蝸殼，去除耳蝸骨壁、血管紋、螺旋韌帶等，全層剝離至頂回，依次將各回基底膜從蝸軸上完整分離下來，清除前庭膜及蓋膜，以蝸尖與前庭窗之間的連線將基底膜分成底、中、頂三段（本實驗動物的實驗方法得到解放軍309醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心和使用委員會批準）。

1.3.2 免疫熒光雙標記染色 將分離好的基底膜置于含0.25%Triton X-100中孵育30 min；一次性塑料吸管吸除PBST液，用PBS緩沖液將基底膜沖洗3次，10分鐘／次；沖洗后的基底膜放置于含3%驢血清封閉液的EP管中30 min，用以阻斷非特異性位點；吸除封閉液，再用PBS緩沖液將基底膜沖洗3次，10分鐘／次；將分離出的基底膜置于山羊抗鼠CtBp2抗體（1：100，PBS溶液稀釋）、兔抗鼠Glu R2／3抗體（1：100，PBS溶液稀釋）的一抗混合液中，放入4℃冰箱過夜；第二天，取出標本，將經一抗染色的基底膜置于PBS緩沖液沖洗3次，10分鐘／次；分別加入驢抗羊FITC（1：100，PBS溶液稀釋）、驢抗兔Ig G-TRITC（1：100，PBS溶液稀釋）抗體，室溫環(huán)境下避光染色30 min；吸除二抗，用PBS緩沖液沖洗3次，10分鐘／次，蒸餾水沖洗1次；解剖顯微鏡下將標本平鋪于滴有DAPI的載玻片上，封片。

1.3.3 激光共聚焦顯微鏡成像 將免疫熒光染色后的標本放置于激光共聚焦顯微鏡下，用波長358 nm的激光激發(fā)DAPI，40倍油浸物鏡下選定觀察位點，并局部數字放大1.5倍，首先定位內毛細胞核，然后用波長494 nm的激光激發(fā)FITC、547 nm的激光激發(fā)TRITC，適當調節(jié)視圖窗口大小，采用雙通道觀察模式，雙標記后的色對呈橙黃色。當特異性熒光出現時，以1.0μm的層距對基底膜行連續(xù)斷層掃描，直至特異熒光點消失為止，采集二維圖像，每一組序列圖像文件放置于一個文件夾內，并按序號排列。

1.3.4 三維建模 在3DS max2012中的頂視窗口中按序列掃描時由上至下的順序調入采集的二維圖像做為視口背景，先調入第一幅二維圖像，在出現橙色熒光的位置畫球體做為標記，再調入下一幅。如果出現橙色熒光的位置與上一幅相同，不做標記，認為是同一個突觸，如果在其他位置上出現橙色熒光，則表示在這一層面上有新的突觸出現，再用球體做出標記［6］。以此類推，最后計算出每條基底膜各段RS的總數及平均每個內毛細胞RS的數量。每個內毛細胞的RS的平均數量為每組基底膜各段每視野中每個內毛細胞RS的平均數量之和的均數，以均數±標準差表示。

1.4 統計學處理 運用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，同一月齡段小鼠耳蝸基底膜不同部位RS總數、不同月齡段小鼠耳蝸基底膜同一部位RS總數以及同一月齡段小鼠耳蝸基底膜不同部位平均每個內毛細胞RS數量和不同月齡段小鼠耳蝸基底膜同一部位平均每個內毛細胞RS數量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用Tukey’s-b檢驗；不同月齡段小鼠不同部位RS總數以及不同月齡段小鼠不同部位平均每個內毛細胞RS數量采用可重復測量雙因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同月齡C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜各段RS總數比較 與2月齡比較，6月齡時小鼠耳蝸基底膜上RS的數量減少主要發(fā)生在底回，中回有少量減少，頂回無變化；10月齡時RS數量在頂回開始減少，中回繼續(xù)減少，底回數量維持不變；12月齡時其數量在頂回、中回繼續(xù)減少，底回數量反而有少許增多（表1，圖1）。

表1 不同月齡C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜各回RS總量（個，±s）

表1 不同月齡C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜各回RS總量（個，±s）

注：*與同月齡中、底回RS比較P＜0.05；△6月齡和10月齡段小鼠耳蝸基底膜頂、中、底回RS總數兩兩比較均為P＜0.05；**與同月齡底回比較，P＜0.05；△△兩兩比較在頂回，除2月與6月齡比較P＞0.05外，其余各月齡比較P＜0.05；在中回，2月齡與6、10、12月齡，6月齡與10、12月齡比較，P＜0.05；在底回，2月齡與6、10、12月齡比較，P＜0.05

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可見，不同月齡及基底膜不同部位對C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜RS總數影響不同，年齡及基底膜不同部位兩因素對基底膜RS總數的影響存在交互作用，即不同年齡、基底膜不同部位RS總數不同。

2.2 C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜各段每個內毛細胞RS平均數量比較 不同月齡小鼠耳蝸基底膜各段平均每個內毛細胞RS數量與耳蝸基底膜各段RS總數結果基本一致（表2）。

表2 不同月齡C57BL／6J小鼠基底膜不同部位每個內毛細胞RS的數量（個，±s）

表2 不同月齡C57BL／6J小鼠基底膜不同部位每個內毛細胞RS的數量（個，±s）

注：*與同月齡中、底回比較P＜0.05；△6月齡和10月齡小鼠耳蝸基底膜頂回、中回、底回上每個內毛細胞RS數量兩兩比較均為P＜0.05；△△兩兩比較在頂回，除2月與6月齡外，其余各月齡比較P＜0.05；在中回，2月齡和6、10、12月齡，6月齡和10、12月齡比較，P＜0.05；在底回，2月齡和6、10、12月齡比較，P＜0.05

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圖1 不同月齡C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜不同部位RS免疫熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下的三通道合成圖像

可見，不同月齡及基底膜不同部位對C57BL／6J小鼠耳蝸基底膜上平均每個內毛細胞RS數量的影響不同，并且，年齡因素和基底膜不同部位兩因素之間對每個內毛細胞RS平均數量的影響存在交互作用，即不同年齡、基底膜不同部位平均每個內毛細胞RS數量不同。

3 討論

耳蝸內毛細胞傳入神經突觸是聲音信息傳遞到中樞神經系統的第一個傳入性的突觸結構，是聲音信號傳導和釋放的重要節(jié)點，在聽覺形成和聽力損傷過程中起著不可替代的作用，各種因素導致帶狀突觸形態(tài)結構、數量及功能發(fā)生改變后，都會引起不同程度的聽力損失。

研究發(fā)現，在成熟的RS中可檢測到20余種蛋白成分，其中RIBEYE是目前已知的帶狀突觸前膜上唯一的特異性蛋白成分，可能具有酶活性［7］。RIBEYE含有A區(qū)和B區(qū)，其中B區(qū)包含除了20個N末端氨基酸以外的C末端結合蛋白2（CtBP2）的全部序列，抗CtBP2的抗體可以與RIBEYE的B區(qū)結合，達到標記突觸前膜的目的。另外，由于內毛細胞與傳入神經纖維突觸間通過谷氨酸受體（glutamate receptor，GluR）介導快速神經傳導，而Glu R2、Glu R3屬于а-氨基羥甲基惡唑丙酸（amino-hydroxy-methyloxazole propionic acid，AMPA）受體類型，位于突觸后神經末梢膜遞質受體斑上，因此，應用抗Glut2／3抗體與GluR2、Glu R3結合，能夠標記突觸后膜。本實驗中選取2、6、10、12月齡的具有先天性遺傳缺陷的C57BL／6J小鼠為實驗對象，通過免疫熒光雙標記的方法對耳蝸基底膜的帶狀突觸前、后膜標進行記，采用激光共聚焦顯微鏡對突觸的每一層面進行雙通道掃描，同時出現紅色和綠色熒光的位點（雙通道合成后的圖像為橙黃色）定位一個完整的RS，可以較為簡便地標記耳蝸基底膜上RS的數量。

本實驗結果顯示，與2月齡比較，6月齡時耳蝸基底膜上RS的數量減少主要發(fā)生在底回，中回有少量減少，頂回無變化；10月齡時RS數量在頂回開始減少，中回繼續(xù)減少，底回減少維持不變；12月齡時其數量在頂回、中回繼續(xù)減少，底回數量反而有所增多。而既往研究發(fā)現，C57BL／6J小鼠隨著月齡增大，在6～8月齡時開始出現聽力下降，ABR反應閾顯示以高頻聽力下降為主［8，9］，這種結構和功能變化的一致性，提示RS數量減少可能與C57BL／6J小鼠聽力損失密切相關。根據Stamataki等［10］的研究，老年小鼠的RS數量較正常青年小鼠明顯減少，其數量幾乎下降至年輕小鼠的一半，從蝸軸方向或從內毛細胞底部觀察發(fā)現，年輕動物傳入神經末梢放射狀分布呈均一性，而老年動物高頻分布區(qū)域出現選擇性缺失。因此推測，在C57BL／6J小鼠年齡增長的過程中，可能由于毛細胞靜纖毛的頂連接結構發(fā)生異常［11，12］，破壞了細胞頂部的機電轉換裝置，導致聲信號在誘導內毛細胞發(fā)生膜電位變化時其幅度明顯增大，其結果使突觸前膜釋放大量的谷氨酸，產生神經毒性作用，誘導傳入神經細胞發(fā)生水腫、變性，甚至壞死等突觸興奮性損傷，這種損傷長時間積累導致帶狀突觸數量和結構的改變，最終影響聽覺功能［13］。

本研究還發(fā)現，C57BL／6J小鼠6月齡時耳蝸基底膜底回RS數量減少最顯著，而此時頂回及中回的突觸數量尚無明顯變化，說明RS的數量首先從底回開始減少。Stamataki等［10］也發(fā)現C57BL／6J小鼠內毛細胞傳入神經突觸的數量在基底膜不同區(qū)域分布不同，老年小鼠耳蝸基底膜底回內毛細胞表面的RS不成比例缺失，而頂回RS相對保留較多；同時老年小鼠底回殘存的RS體積增大，神經末梢內線粒體體積也明顯大于年輕動物，但是突觸的囊泡數量減少，這些亞細胞結構的改變可能會直接降低胞吐效率。因此，根據基底膜底回帶狀突觸形態(tài)和數量的變化，推測C57BL／6J小鼠基底膜高頻區(qū)域RS比低頻區(qū)域更易受到不良因素的影響而發(fā)生缺失，這與老年性聾患者的聽力首先從高頻區(qū)開始下降相一致。另外，文中結果顯示C57BL／6J小鼠在10月齡和12月齡時耳蝸基底膜RS數量又出現緩慢增加的現象，其原因可能與某種代償機制有關，機體可能存在以增加突觸數量來代償聽力損失的機制，可能與帶狀突觸在數量上的可塑性有關［14］，有待于擴大研究小鼠的月齡范圍進一步探討。

研究提示C57BL／6J小鼠耳蝸內毛細胞RS數量減少可能發(fā)生在老年性聾的早期階段，針對RS數量減少采取有效治療措施可能為早期干預老年性聾提供重要實驗依據。但是由于實驗條件的限制，本研究僅止步于12月齡C57BL／6J小鼠，缺乏對同系更年長的小鼠及其它鼠系的進一步比較研究，同時在老年性聾發(fā)生發(fā)展的過程中，RS的形態(tài)、功能及數量的變化是一個十分復雜的過程，其具體機制還需長期和深入的探索。另外，由于多重免疫熒光標記的局限性，只能對RS數量進行計數，無法觀察單個突觸的形態(tài)和其亞細胞結構的變化，有待于今后利用電鏡技術進一步研究。

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9 Sidi S，Busch-Nentwich E，Friedrich R，et al.Gemini encodes a zebrafish L-type calcium channel that localizes at sensory hair cell ribbon synapses［J］.J Neurosci，2004，24：4213. 10 Stamataki S，Francis HW，Lehar M，et al.Synaptic alterations at inner hair cells precede spiral ganglion cell loss in aging C57BL／6J mice［J］.Hear Res，2006，221：104.

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（2014-06-23收稿）

（本文編輯 周濤）

The Changes of the Number of Ribbon Synapse in lnner Hair Cells of C57BL／6J Mice with Age

Li Xiaorui*，Jiang Xingwang，Zhang Yanping
（*Department of Otolaryngology，309thHospital of Chinese PLA，Beijing，100091，China）

Objective To investigate the number changes of the ribbon synapses（RS）in the inner hair cell of C57BL／6J mice with age.Methods The cochlear basilar membrane was obtained from C57BL／6J mice in 2，6，10，12 months old.RIBEYE on the presynaptic membrane and AMPA receptor on the postsynaptic membrane were double labeled by immunofluorescence histochemical technique.The stained sections were observed under a confocal laser-scanning microscope.Then the number of RS of the basilar membrane was calculated by three dimensional reconstruction images using 3DS max software.Results The numbers of RS reduced gradually from the cochlear apex to base in the same developing stages.The numbers of RS in apex and middle turn of cochlea were gradually reduced with the age increasing.The number of RS in basilar turn reduced first and increased slowly then.Conclusion The decreases of the number of RS maybe the main pathological change at the early stage of presbycusis.In addition，there may be a kind of compensatory mechanism by increaseing the number of RS to delay the hearing deficits.

C57BL／6J mice； Inner hair cell； Ribbon synapse

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.02.014

時間：2015-3-3 14：39

R764.43+6

A

1006-7299（2015）02-0176-05

△ 北京市自然科學基金面上項目（7142155）、2013年度全軍保健專項科研課題（13BJZ24）、全軍十二五面上項目（11MS013）、總參軍事醫(yī)學和老年病科研基金重點項目（ZCW14B07）、中國人民解放軍第309醫(yī)院院內課題面上課題（2014MS-015）聯合資助

1 中國人民解放軍第309醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京 100091）；2 山西醫(yī)科大學

李曉瑞，女，山西人，在讀碩士研究生，主要研究方向為老年性聾的發(fā)病機制。現在山西省運城市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科工作。

張延平（Email：yzhan28@163.com）

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1439.015.html