李 慧，劉永娣，羅 姍，王春華，朱士茂，張 佩，丁玉江，郭采平

狂犬病病毒CTN-1株在雞胚細胞馴化過程中G基因和滴度分析

李 慧，劉永娣，羅 姍，王春華，朱士茂，張 佩，丁玉江，郭采平

目的 研究狂犬病病毒CTN-1株在雞胚細胞馴化過程中的特性。方法 利用RT-PCR反應(yīng)擴增CTN-1株19個代次的G蛋白基因，獲得cDNA進行序列測定；并以免疫熒光法測定各代次毒株在細胞中的滴度。結(jié)果 序列測定顯示：CTN-1株在雞胚細胞馴化過程中G蛋白基因序列發(fā)生不同程度變異且逐步積累，從第30代開始，G蛋白基因序列趨于穩(wěn)定。與CTN-1株相比，CTN-1雞胚細胞馴化株在G蛋白的第147、333、389、421和485位氨基酸發(fā)生了突變。與此相對應(yīng)，CTN-1株雞胚細胞馴化株滴度逐漸趨于穩(wěn)定，并于第33-58代滴度維持在10～101 g細胞熒光轉(zhuǎn)化灶單位/mL左右。G蛋白同源性分析表明，CTN-1株雞胚細胞馴化株與我國近期不同區(qū)域分離得到的街毒株具有較高同源性，其G蛋白氨基酸同源性為89.3%～99.0%。結(jié)論 CTN-1株在雞胚細胞馴化過程中G蛋白基因發(fā)生穩(wěn)定變異，滴度在傳代后33-58代達到較高水平，穩(wěn)定性較好，適于我國狂犬病防治的實際應(yīng)用。

狂犬病病毒;CTN-1;G蛋白;序列測定;滴度

狂犬病病毒(Rabies virus, RV)屬于彈狀病毒科、狂犬病病毒屬的一種嚴(yán)格嗜神經(jīng)性病毒，可以引起人獸共患病，一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100%[1]。全世界每年因狂犬病死亡的人數(shù)約為55 000，其中絕大多數(shù)病例發(fā)生在發(fā)展中國家[2]。我國是狂犬病高發(fā)國家，發(fā)病和死亡人數(shù)僅次于印度，居世界第2位[2]。至今人們?nèi)晕茨芡耆私釸V的致病機理，接種狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病發(fā)生最重要和最有效的措施[3]。

當(dāng)前在我國使用的人用狂犬病疫苗株有aG，PV和CTN株[4]。CTN-1是我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的毒株，最早在1956年從山東淄博市狂犬病患者分離[3]。目前已對CTN-1株的基因組和結(jié)構(gòu)基因序列、表型、生物學(xué)和抗原性等進行了全面研究，發(fā)現(xiàn)相比于其他疫苗株，CTN-1株與近30年來在中國不同區(qū)域分離得到的流行RV街毒株的親緣關(guān)系更為密切，表明CTN-1株更適合用于我國的狂犬病防治[5]。目前有關(guān)CTN-1株的研究基本為Vero細胞適應(yīng)株的報道，且當(dāng)前我國人用狂犬病疫苗也全部是以Vero細胞作為培養(yǎng)基質(zhì)[3]，而對于CTN-1株適應(yīng)于原代雞胚細胞(Chicken embryo cells，CECs)的生物學(xué)特性還未有研究報道[6]。本研究對CTN-1株在雞胚細胞馴化過程中不同代次毒株的滴度及G蛋白基因的序列進行測定，觀察病毒滴度和G蛋白基因序列與病毒馴化代次之間的關(guān)系，為評價CTN-1雞胚細胞馴化株(CTN-1 chicken embryo cells domesticated strain，簡寫為CTNCEC-Dom株)用于中國疫苗生產(chǎn)的適用性、有效性和穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞 CTNCEC毒株：取CTN-1株(來源：中國食品藥品檢定研究院，vero細胞5代，即CTN-1V5)先經(jīng)vero細胞傳8代后再經(jīng)原代雞胚細胞連續(xù)傳代獲得的不同代次的雞胚細胞毒株。取CTNCEC-1、5、6、10、15、20、25、26、27、30、31、32、33、36、40、45、50、55和60毒株分別進行滴度和序列測定。原代CECs為本疫苗研究室從9～11日齡雞胚中制備得到；BSR細胞來自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所惠贈。

1.2 主要試劑 QIAampViral RNA Mini Kit試劑盒購自QIAGEN公司；First Strand Cdna Synthesis Kit(ReverTra Ace-α-)試劑盒購自TOYOBO公司；Platinum Taq DNA HIF I Polymerase (5 U/蘈l)購自Invitrogen公司；PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計及合成 G蛋白基因特異性測序引物參考CTN-1全基因組序列(GenBank序列號FJ959397)。使用DNAStar軟件中的PrimerSelect工具設(shè)計，序列分別為CTN-MGL-F1 (5′-ATACGGGCTTAACTCCAACCT-3′，參考序列位置3157-3177 nt)和CTN-MGL-R (5′-GCTCGGCCTCTGACTCAAT-3′，參考序列位置5453-5471 nt)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取及PR-PCR CTN-1株馴化過程中不同代次RV經(jīng)原代雞胚細胞傳一代，收集細胞培養(yǎng)上清液，用QIAamp UltraSens Virus Kit從上清液提取狂犬病病毒RNA，用ReverTra Ace-α-逆轉(zhuǎn)錄成CDNA。

1.5 PCR擴增及測序 PCR反應(yīng)體系(50 μL)如下：10 × PCR緩沖液5 μL，CDNA模板1 μL，10 mmol/L DNTP 1 μL，20 μmol/L的上下游引物各1 μL，Platinum Taq DNA HIF I Polymerase (5 U/μL) (Invitrogen公司) 0.2 μL，去離子水40.8 μL，PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30s，68 ℃ 3 min，30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，用PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit回收擴增產(chǎn)物。然后將回收的擴增片段連接到PMD18-T載體(TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆進行序列測定。

1.6 病毒滴度測定 應(yīng)用細胞熒光轉(zhuǎn)化灶單位實驗(Fluorescence Focus Units Assay, FFU)測定各毒株的滴度[7]。在96孔微量培養(yǎng)板中3倍系列稀釋病毒樣品，并加入BSR細胞懸液至終濃度為1 × 105個細胞/孔，混勻置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，用PBS洗1次，然后每孔加入50 μL 80%冷丙酮于4 ℃固定20 min。棄丙酮，室溫放置待丙酮揮發(fā)后，加入工作濃度的熒光素標(biāo)記抗狂犬病病毒N蛋白單抗(Millipore, 5100)，50 μL/孔，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，加甘油后置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，取>10和<10個熒光灶的相鄰兩孔稀釋度的數(shù)據(jù)進行計算。病毒滴定(FFU/mL)=[(低稀釋度的熒光平均數(shù)+高稀釋度的熒光平均數(shù)× 3)/2]×稀釋倍數(shù)×1 000/50[6]。

2 結(jié) 果

2.1 CTNCEC 1-60代19個毒株G蛋白核苷酸序列的比較 本研究選取的19個代次毒株G蛋白核苷酸數(shù)量及其編碼框架均沒變化，各代次編碼框具有高度一致性，均在99.7%以上，詳見表1。從表中可看出，CTN-1株為了適應(yīng)雞胚細胞，G基因序列發(fā)生了一定的變化。從雞胚細胞傳代第1代開始，CTN-1的G蛋白基因在第4538、4636、4826和5251位核苷酸位點發(fā)生突變，分別由G、A、T和C變成了A、G、C和A，這些突變位點一直保持到第5代；從第6代開始，G蛋白基因新增加4371位突變，相應(yīng)核苷酸由G突變成A，這些突變在第5、10、20和25代毒株中保持不變；從第26代開始，G蛋白基因在第4635位核苷酸發(fā)生突變，由C變成A；第27代次毒株G蛋白基因序列與26代相同；從第30代開始，G蛋白基因序列再增加一個突變，第3812位核苷酸由A變成G，毒株G蛋白基因序列保持穩(wěn)定，至60代序列不再發(fā)生變化。

表1 各代次CTNCEC毒株G蛋白基因核苷酸及氨基酸序列變化

Note:anucleotide in the 3′ UTR of the G gene,bno change.

2.2 CTNCEC 1-60代19個毒株G蛋白氨基酸序列的比較 研究表明，G蛋白是RV的主要保護性抗原，是RV結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的蛋白[3]。序列分析表明，從30代開始，CTN-1在雞胚細胞中穩(wěn)定后，G蛋白在第147 (K→E)、333 (R→Q)、389 (E→K)、421 (P→Q)和485 (S→P)位氨基酸發(fā)生突變(表1)。在這些位點突變的氨基酸中，已知第147和333位氨基酸對于RV致病性至關(guān)重要，單一突變?nèi)魏我粋€氨基酸就足以嚴(yán)重削弱病毒的致病力。此外，G蛋白的第194位氨基酸沒有發(fā)生突變，因此不會發(fā)生因G蛋白第194 (N→K)和333位氨基酸(K→Q)同時突變而增強毒株對成年鼠致病性的情況[8]。這些結(jié)果表明，CTN-1株在雞胚細胞傳代過程中對小鼠的致病力逐漸減弱。因此，我們把CTNCEC-30代定為CTNCEC-Dom株。

2.3 CTNCEC 1-60代19個毒株滴度的變化 利用細胞熒光轉(zhuǎn)化灶單位實驗(Fluorescence Focus Units Assay, FFU)測定各代次毒株的滴度，結(jié)果如圖1所示。從CTN-1在雞胚細胞上傳第1代開始，病毒滴度從9.0 lgFFU/mL下降到4.7 lgFFU/mL，第5代開始，毒株的滴度隨著傳代次數(shù)的增加而增加；到第30代左右，病毒滴度趨近穩(wěn)定，病毒滴度在58代前維持在7.0 ～7.5 lgFFU/mL左右。

2.4 CTNCEC-Dom株G蛋白氨基酸同源性分析 為了進一步研究CTNCEC-Dom株G蛋白與其他疫苗株或近期我國不同區(qū)域分離得到的野生街毒株直接的親緣關(guān)系，從GenBank中選取若干種已公開發(fā)表的RV疫苗株和街毒株的G蛋白基因序列(如表2中所示)，與CTNCEC-Dom株的G蛋白進行氨基酸同源性比較分析。同時，我們也對G蛋白的抗原位點II、III和線性表位G5進行了同源性分析，結(jié)果見表2所示。通過比較發(fā)現(xiàn)，CTNCEC-Dom株與疫苗株G蛋白全長同源性在89.3%～

圖1 各代次CTNCEC毒株雞胚細胞傳代病毒滴度曲線圖

99.0%之間，抗原位點II同源性在91.6%～99.4%之間，抗原位點III在89.3%～96.4%之間，線性表位G5之間的同源性在89.5%～100.0%之間。當(dāng)與街毒株進行比較時，G蛋白全長、抗原位點II、抗原位點III和線性表位G的同源性分別為86.3%～96.8%、83.2%～98.2%、85.7%～96.4%和89.5%～97.4%?？梢奀TNCEC-Dom株與疫苗株G蛋白以及國內(nèi)多數(shù)狂犬病街毒株G蛋白的親緣關(guān)系密切，其中CTNCEC-Dom株與其出發(fā)母株CTN-1的同源性最高，G蛋白全長、抗原位點II、抗原位點III和線性表位G的同源性高達99.0%、99.4%、96.4%和100.0%。

表2 CTNCEC-Dom株G蛋白氨基酸序列與其他疫苗株和街毒株同源性分析

Tab.2 Homologies of the chicken embryo cell-domesticated virus strain G protein with those of other vaccine and street strains isolated

StrainAccessionno.HostAreayearAminoacidhomology(%)Full-lengthAntigensiteIIAntigensiteIIIG5VaccineCTN-1FJ959397HumanChinaShandong195699.099.496.4100.0strainsSAG2EF206719DogFrance-92.094.092.992.1ERAEF206707DogUSA193592.293.492.994.7SADB19M31046DogUSA193592.094.092.992.1HEP-FluryAB085828DogUSA193992.294.696.489.5FluryLEPDQ099524DogGermany-92.494.689.392.1PM1503DQ099525CowGermany-89.591.692.994.7PVM13215DogFrance188292.294.096.494.73aGL04522DogChinaBeijing193189.392.296.494.7IsolatedHN10EU643590DogChinaHunan200796.898.296.497.4streetBD06EU549783DogChinaHebei200692.994.692.992.1strainsDRVDQ875051DeerChinaJilin198986.683.292.994.7MRVDQ875050MouseChinaHenan198988.792.292.994.7FJ008FJ866835DogChinaFujian200893.595.292.992.1JX08-45GU647092ErmineChinaJiangxi200896.096.496.497.4GuizhouA10(H)EU267745HumanChinaGuizhou200491.693.489.394.7Hebei0(H)EU267752HumanChinaHebei200792.795.892.992.1HNDB28EU008927DogChinaHunan200594.395.892.992.1Hubei0703081EF643518CowChinaHubei200794.195.892.992.1WG430DQ849060DogChinaHunan200593.995.892.992.1WG432DQ849059DogChinaHunan200593.995.892.992.1Yunnan_MD06EU253477DogChinaYunnan200693.595.892.992.1FY1DQ849044DogChinaAnhui200493.995.892.992.1Yue1DQ849070DogChinaGuangxi199793.595.892.992.1JiangsuWx0(H)EU267772HumanChinaJiangxi200492.093.492.992.1NCDQ849064DogChinaJiangxi200493.795.892.994.7CQ92DQ849072DogChinaChongqing199294.896.496.494.7Yunnan_Qj07EU275240DogChinaYunnan200793.795.892.992.1YunnanTc06EU275242DogChinaYunnan200693.594.692.989.5

3 討 論

CTN-1株于1956年分離自山東省死于狂犬病患者的腦組織，并先后在小鼠腦內(nèi)和人二倍體細胞株多次連續(xù)傳代而獲得。此毒種后來又經(jīng)在Vero細胞上連續(xù)多次傳代而適應(yīng)該細胞[3]。因CTN-1株與國內(nèi)大多數(shù)街毒株的同源性高于其他疫苗株，因此更適合制備用于預(yù)防中國狂犬病的滅活疫苗[5]。當(dāng)前我國使用的狂犬病疫苗絕大多數(shù)是Vero細胞培養(yǎng)的，而Vero細胞屬于傳代細胞系，存在一定的致癌風(fēng)險[9]。雞胚細胞作為原代細胞，其基因型保持不變，在應(yīng)用上非常安全[6]。本研究對本公司得到的CTNCEC-Dom株的一些生物學(xué)特征進行分析，為其應(yīng)用于我國的狂犬病疫苗生產(chǎn)中的優(yōu)勢提供理論依據(jù)。

CTN-1在雞胚細胞馴化過程中滴度逐漸增加，并在第30代左右滴度維持穩(wěn)定，表明此時CTN-1已經(jīng)適應(yīng)雞胚細胞。G蛋白是RV的主要保護性抗原，是RV結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的蛋白。研究表明，G蛋白抗原位點II中的第147、184、198～200以及34～42位氨基酸對于RV致病力至關(guān)重要，這些氨基酸的突變將嚴(yán)重削弱RV的致病力[3]；而第333～338位氨基酸是抗原位點III的中和抗體主要結(jié)合部位，尤其是第333、336和338位的氨基酸最為重要[3]。從序列分析、與其他RV疫苗株和街毒株的G蛋白基因序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，CTNCEC-Dom株跟多數(shù)疫苗株和國內(nèi)街毒株具有高度的同源性，其中與CTN-1株的同源性最高，全長同源性達可達99.0%，線性表位同源性可達到100.0%，抗原位點II為99.4%，最低是抗原位點III為96.4%，這是因為CTNCEC-Dom株G蛋白在第147、333、389、421和485位氨基酸發(fā)生突變，其中包括對于RV致病性至關(guān)重要的第147和333位氨基酸，因此會大大降低毒株對成年小鼠的致病性[8-9]；G蛋白第389和421位氨基酸在一些RV流行街毒株中高度保守，特別是第421位的脯氨酸在不同狂犬病病毒屬中也高度保守，推測這兩個氨基酸的突變可能會影響毒株在細胞中的復(fù)制。因G蛋白的第485位氨基酸位于G蛋白膜內(nèi)區(qū)，且在不同毒株之間保守性較低，推測該位點的突變可能會影響G蛋白與病毒粒子內(nèi)部的病毒蛋白或者與宿主蛋白的相互作用[3]。

雖然已有大量的研究表明CTN-1更加適合我國人用狂犬病疫苗的生產(chǎn)[5]，且已有CTN-1疫苗上市，但這些疫苗全部是基于Vero傳代細胞系。盡管國外已有純化雞胚細胞疫苗上市，并且已有研究證明純化雞胚細胞培養(yǎng)疫苗和人二倍體細胞疫苗的效果可比，是WHO推薦的疫苗之一，但目前國內(nèi)還沒有雞胚細胞適應(yīng)株的報道。本文對CTNCEC-Dom株的一些生物學(xué)特征進行研究，并分析了其與其他疫苗株和街毒株的G蛋白同源關(guān)系，為該毒株的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Characterization of G gene and titer of the rabies virus CTN-1 strain during adaptation to chicken embryo cells

LI Hui,LIU Yong-di,LUO Shan,WANG Chun-hua,ZHU Shi-mao,ZHANG Pei,DING Yu-jiang,GUO Cai-ping

(ShenzhenWeiguangBiologicalProductsCo.,Ltd,Shenzhen518107, China)

In this study, the characteristics of the rabies virus strain CTN-1 during domestication to chicken embryo cells (CECs) were investigated. The G genes of 19 CTN-1 passages during domestication to CECs were PCR-amplified and completely sequenced. The titers of these 19 CTN-1 passages were determined by the fluorescence focus units’ assay. Results revealed that the G gene accumulated mutations during domestication of CTN-1 to CECs, and maintained stable from passage 30. Sequence comparison showed that amino acid residues at 147, 333, 389, 421, and 485 in the G protein were mutated in CEC-domesticated CTN-1 strain compared to the parent CTN-1 strain. Titration analysis demonstrated that the titers gradually increased during CTN-1 domestication to CECs and plateaued at 10-101 gfluorescence focus unit/mL during passages 33-58. Homology analysis showed that the CEC-domesticated CTN-1 strain was closely related to virus strains that were recently isolated from different regions in China and the full length G amino acid sequence homologies among the CEC-domesticated CTN-1 strain and other virus strains ranged from 89.3% to 99.0%. Taken together, the above results demonstrated that the G gene accumulated stable mutations during domestication of CTN-1 to CEC and the domesticated virus achieved high titers in CEC from passages 33 - 55, thus potentiating its utility in rabies prevention and control in China.

rabies virus; CTN-1; glycoprotein; sequence determination; titer

Guo Cai-ping, Email:gcpzxy0402@aiyun.com

郭采平，Email：gcpzxy0402@aiyun.com

深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司，深圳 518107

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.011

R373.9

A

1002-2694(2015)02-0143-05

2014-04-30；

2014-11-20