張 冉 王全義 張軍臣 于珊珊 王海濤 敖啟林

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029；2濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院，濟(jì)寧 272049)

·臨床醫(yī)學(xué)·

IMP3蛋白及Ki-67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義*

張 冉1王全義1張軍臣1于珊珊2王海濤1敖啟林1

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029；2濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院，濟(jì)寧 272049)

目的 探討胰島素樣生長因子IImRNA結(jié)合蛋白3(IMP3蛋白)及Ki-67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及臨床意義。方法 選取我院2008年1月至2012年10月手術(shù)切除的不同級別的膠質(zhì)瘤60例(Ⅰ級5例，Ⅱ級20例，Ⅲ級20例，Ⅳ級15例)及5例正常腦組織，應(yīng)用免疫組化Envision二步法檢測IMP3蛋白及Ki-67在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，分析二者與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系以及二者的相關(guān)性。結(jié)果 IMP3 在膠質(zhì)瘤各級別的表達(dá)中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.17，P<0.05),其中膠質(zhì)瘤Ⅲ～Ⅳ級陽性表達(dá)率明顯高于 Ⅰ～Ⅱ級(91.4% vs 8%，χ2=41.34，P<0.05)。膠質(zhì)瘤標(biāo)本的Ki-67指數(shù)(Ki-67 LI)范圍為0% ～ 50%， 在膠質(zhì)瘤各級別的表達(dá)中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.80，P<0.05),其中膠質(zhì)瘤Ⅲ～Ⅳ級陽性表達(dá)率明顯高于 Ⅰ～Ⅱ級(91.4% vs 20%，χ2=50.29，P<0.05)。IMP3 蛋白的陽性表達(dá)率與 Ki-67 蛋白的陽性表達(dá)率有正相關(guān)性(r=0.774，P<0.05)。結(jié)論 IMP3及Ki-67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)，二者聯(lián)合應(yīng)用可作為評價(jià)膠質(zhì)瘤級別的重要參考指標(biāo)。

胰島素樣生長因子IImRNA結(jié)合蛋白3；細(xì)胞增殖核抗原Ki-67；膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤，由于血腦屏障的特殊結(jié)構(gòu)，一般化療藥物的療效不顯著。因此，腦膠質(zhì)瘤治愈率差，復(fù)發(fā)率、致殘率以及死亡率高，是全身惡性腫瘤中預(yù)后最差者之一。胰島素樣生長因子IImRNA結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor II mRNA-binding protein 3，IMP3)是癌胚RNA結(jié)合蛋白，它在胚胎形成時(shí)調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子II(IGF-II)的轉(zhuǎn)錄,在許多正常組織中的表達(dá)非常低。一些腫瘤被發(fā)現(xiàn)表達(dá)IMP3蛋白，包括肺癌、直腸癌、胰腺癌[1-3]以及發(fā)生于他組織的腫瘤。細(xì)胞增殖核抗原Ki-67(nuclear-associated antigen Ki-67)是評價(jià)腫瘤增殖程度的較好指標(biāo)。它廣泛表達(dá)于增殖期細(xì)胞，而靜止期細(xì)胞則不表達(dá)[4]。Ki-67表達(dá)水平反映了細(xì)胞增殖情況，是目前腫瘤增殖活動研究中較為精確、可靠的增殖期標(biāo)志物。

雖然IMP3是近年來基礎(chǔ)與臨床的研究熱點(diǎn)，但目前在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中關(guān)于IMP3的表達(dá)研究不多，本課題研究IMP3和Ki-67在各級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究資料

選取2008年1月至2012 年10月濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本60例及正常腦組織5例。其中男47例，女18例；平均年齡(47.4±9.5)歲。 所有切片均經(jīng)兩名病理專業(yè)高級職稱醫(yī)師共同診斷，并參考免疫組織化學(xué)如GFAP、Olig-2、CD34、EMA、Ki-67等結(jié)果，以世界衛(wèi)生組織WHO(2000)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)(核異型性、核分裂象、血管增生和/或壞死)，將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級。在60例膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中，Ⅰ級5例、Ⅱ級20例、Ⅲ級20例、Ⅳ級15例；其中節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤3例，毛細(xì)胞星型細(xì)胞瘤2例，彌漫型星型細(xì)胞瘤21例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤15例，間變型室管膜細(xì)胞瘤4例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 15 例。

1.2 儀器設(shè)備

石蠟切片機(jī) LEICA-RM2245(德國)；YF-TFB型生物組織攤烤片機(jī)(湖北孝感亞光醫(yī)療電子有限公司)；KB-TK-72精密烤箱(東莞科寶)；家用微波爐( 美的)；冰箱BCD-206TS(青島Hair)；隔水式電熱恒溫箱(上海)；微量移液器(上海大邁儀器有限公司)；光學(xué)照相顯微鏡(LEICA-DM2500德國)；WMY-01數(shù)顯溫控儀 (上海)；101-A 型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京永光明醫(yī)療儀器廠)；高清晰度彩色病理圖片分析系統(tǒng)(西安華海HMIAS)。

1.3 試劑

鼠抗人IMP3單克隆抗體(英國 DAKO公司)；免疫組化試劑盒(SP)(北京中杉生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京金橋生物技術(shù)有限公司)；APES 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；緩沖液 (0.05M PBS pH 7.4 緩沖液，0.05M pH 6.0檸檬酸緩沖液)、梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)、二甲苯、松節(jié)油、甘油、丙酮、過氧化氫、碳酸氫二鈉、蘇木精、伊紅染液等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1)石蠟切片，厚4μm，將石蠟組織片貼附于防脫多聚賴氨酸載玻片上，置于60℃烤箱中烤片1h，取出備用。2)石蠟切片脫蠟。3)將切片置于3%過氧化氫中，10min后取出，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶PBS沖洗3次，每次5min。4)對組織抗原進(jìn)行修復(fù)，取一定量EDTA緩沖液(pH=9.0)于抗原修復(fù)盒中，將組織切片置于塑料切片架上，微波爐中火修復(fù)10min，取出，冷卻至室溫。之后用PBS洗3次，每次5min。5)甩去切片PBS液，每張切片加50μl IMP-3(1∶50稀釋)，37℃下靜置1h。6)用PBS液沖洗3次，每次5min。7)甩去切片PBS液，每張切片加Envision DAB-A 50μl 37℃烤箱中靜置30min或者室溫下靜置1h。8)PBS液沖洗3次，每次5min。9)甩去切片PBS液，每張切片加100μl DAB顯色劑工作液(DAB-B液與DAB-C液比例為50∶1，避光，用前30min配制)。鏡下觀察3～10min，陽性顯色為棕黃色顆粒。10)用蒸餾水沖洗10min，蘇木素復(fù)染2min，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗10～15min。11)脫水，透明，封片，鏡檢。

1.5 結(jié)果判定

IMP3陽性細(xì)胞百分比評分：陰性(-),未見著色細(xì)胞；弱陽性(+)，著色細(xì)胞數(shù)<25%；中度陽性()，著色細(xì)胞數(shù)占 25%～ 50%；強(qiáng)陽性()，著色細(xì)胞數(shù) > 50 %。

Ki-67蛋白一般采用 Ki-67 指數(shù)(Ki-67LI)表示細(xì)胞的增殖程度，高倍鏡 (×400)下每個(gè)視野數(shù) 200 個(gè)瘤細(xì)胞，計(jì)算其陽性細(xì)胞所占百分比。陰性(-)，著色細(xì)胞<5%；弱陽性(+)，著色細(xì)胞數(shù)5%～10%；中度陽性(),著色細(xì)胞數(shù)占 11% ～ 25%；強(qiáng)陽性(),著色細(xì)胞數(shù)>25%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0處理,應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析IMP3和Ki67在各級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，應(yīng)用 Spearman 等級相關(guān)性分析進(jìn)行IMP3和Ki67的相關(guān)分析，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IMP3在各級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

IMP3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，在正常腦組織中無表達(dá)，在膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅰ級未見有表達(dá)(見圖1)，但隨著膠質(zhì)瘤級別的升高，IMP3表達(dá)強(qiáng)度也隨著增加(見圖2～圖4)。

圖1 IMP3在WHO I級膠質(zhì)瘤中的陰性表達(dá)(×100)

圖2 IMP3在WHO II級膠質(zhì)瘤中的弱陽性表達(dá)(×200)

圖3 IMP3在WHO III級膠質(zhì)瘤中的中陽性表達(dá)(×200)

圖4 IMP3在WHO IV級膠質(zhì)瘤中的強(qiáng)陽性表達(dá)(×100)

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在膠質(zhì)細(xì)胞瘤I級陽性表達(dá)率為0%，膠質(zhì)細(xì)胞瘤II級陽性表達(dá)率為10%(弱陽2例、中陽0例、強(qiáng)陽0例)，膠質(zhì)細(xì)胞瘤III級陽性表達(dá)率為90%(弱陽6例、中陽10例、強(qiáng)陽2例)，膠質(zhì)細(xì)胞瘤IV級陽性表達(dá)率為93.3%(弱陽0例，中陽1例，強(qiáng)陽13例)。IMP3 在膠質(zhì)瘤各級別的表達(dá)中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.17，P<0.05),其中膠質(zhì)瘤III～I(xiàn)V 級陽性表達(dá)率明顯高于 Ⅰ～Ⅱ 級(91.4% vs 8%，χ2=41.34，P<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 IMP3在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

2．2 Ki-67在各級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

Ki-67表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，以核內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色染色為陽性。正常腦組織中未見陽性表達(dá)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的Ki-67染色范圍為0%～50%，Ⅰ級膠質(zhì)瘤為陰性表達(dá)(見圖5)，但隨著膠質(zhì)瘤級別的升高，Ki-67表達(dá)強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)(圖6～8)

圖5 Ki-67在WHO I級膠質(zhì)瘤中的陰性表達(dá)(×100)

圖6 Ki-67在WHO II級膠質(zhì)瘤中的弱陽性表達(dá)(×200)

圖7 Ki-67在WHO III級膠質(zhì)瘤中的中陽性表達(dá)(×100)

圖8 Ki-67在WHO IV級膠質(zhì)瘤中的強(qiáng)陽性表達(dá)(×200)

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Ⅰ級膠質(zhì)瘤的陽性表達(dá)率為0%、Ⅱ級膠質(zhì)瘤的陽性表達(dá)率為25%(弱陽性4例，中陽性1例，強(qiáng)陽性0例)、Ⅲ級膠質(zhì)瘤陽性表達(dá)率為90%(弱陽性17例，中陽性1例，強(qiáng)陽性0例)、Ⅳ級神經(jīng)膠質(zhì)瘤陽性表達(dá)率為93.3%(弱陽性5例，中陽性7例，強(qiáng)陽性2例)。Ki67 在膠質(zhì)瘤各級別的表達(dá)中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.80，P<0.05),其中膠質(zhì)瘤Ⅲ～Ⅳ級陽性表達(dá)率明顯高于 Ⅰ～Ⅱ 級(91.4% vs 20%，χ2=50.29，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 Ki-67在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

2．3 腦膠質(zhì)瘤中IMP3和Ki-67表達(dá)的關(guān)系

在 60 例腦膠質(zhì)瘤中，IMP3 蛋白的陽性表達(dá)與 Ki-67 蛋白的陽性表達(dá)采用 Spearman 等級相關(guān)性分析(r=0.774，P<0.05)。二者呈正相關(guān)。見表3。

表3 IMP3和Ki-67的表達(dá)關(guān)系

3 討論

高級別的惡性程度較高的腦膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，腦膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長，總體療效不佳，尤其是惡性程度較高的膠質(zhì)瘤，具有高度間變的生長特點(diǎn)，術(shù)后復(fù)發(fā)快，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類的健康。而腫瘤細(xì)胞的惡性程度則和其增殖能力，以及誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜的能力有關(guān)。

IMP3在胚胎形成時(shí)調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)IGF-Ⅱ的表達(dá)，而在肝癌和癌旁肝組織中均有IGF-Ⅱ的異常表達(dá)[5-7],IGF-Ⅱ基因高表達(dá)可能不僅與IGFn基因的異常表達(dá)有關(guān)，也與IMP3異常調(diào)控有關(guān)。IMP3促進(jìn)IGF-Ⅱ mRNA的翻譯，進(jìn)而增加IGF-Ⅱ水平。而IGF-Ⅱ和細(xì)胞表面的受體(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ受體)結(jié)合，產(chǎn)生胞漿內(nèi)循環(huán)短路，放大了細(xì)胞持續(xù)生長信號的傳遞，加速了腫瘤細(xì)胞的增殖，維持其惡性表型[7-8]。

Findeis-Hosey等研究報(bào)道小鼠IMPS家族基因缺失可使CD44mRNA的下調(diào)，CD44是一種細(xì)胞黏附分子，能促使Ⅳ型膠原蛋白的降解并與細(xì)胞骨架蛋白相結(jié)合，CD44的下調(diào)可降低細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附，促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9]。IMP3還可間接調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白1的表達(dá)，IMPS家族基因缺失可使基質(zhì)金屬蛋白1降低對細(xì)胞外基質(zhì)的浸潤，而細(xì)胞外基質(zhì)的降解又是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成的重要因素；因此認(rèn)為IMP3還能夠間接通過CD44和基質(zhì)金屬蛋白酶等途徑參與了腫瘤惡性生物行為[10]。

Ki-67是一種核抗原蛋白，其在增殖細(xì)胞核中特異性表達(dá)， 它半衰期較短，其陽性表達(dá)覆蓋整個(gè)有絲分裂期，受背景干擾較小，能夠反映腫瘤的惡性程度及患者的預(yù)后[11]。被眾多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的一個(gè)重要指標(biāo)[12]。

本文結(jié)果顯示，IMP3蛋白主要表達(dá)于高級別的膠質(zhì)瘤中，且隨著組織分級的增加其表達(dá)率增加，提示其可能通過調(diào)節(jié)IGF-Ⅱ、CD44、基質(zhì)金屬蛋白酶等參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長過程；Ki-67在高級別膠質(zhì)瘤(Ⅲ ～ Ⅳ級)中的 陽性表達(dá)率明顯高于低級別膠質(zhì)瘤(Ⅰ ～ Ⅱ級)，提示隨著膠質(zhì)瘤的級別及惡性程度的增高，腫瘤細(xì)胞的增殖能力增加。

綜上所述，IMP3及Ki-67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。我們認(rèn)為二者聯(lián)合應(yīng)用可作為評價(jià)膠質(zhì)瘤級別及判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。IMP3和Ki-67在膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，但機(jī)制及通路有所不同，具體關(guān)系還需要增加病例量及采用先進(jìn)觀察方法進(jìn)一步深入研究。

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本刊編輯部

Expression and clinical significance of IMP3 and Ki-67 in hunman gliomas

ZHANGRan,WANGQuanyi,ZHANGJunchen，YUShanshan，WANGHaitao，AOQilin

(Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, China)

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of insulin-like growth factor II mRNA-binding protein 3 (IMP3) and Ki-67 in human brain glioma.Methods60 different grade of gliomas were selected from 2005 to 2012 in our hospital (grade I 5 cases, grade II 20 cases, grade III 20 cases, grade IV 15 cases) and 5 cases of normal brain tissue. The expression of IMP3 and Ki-67 was detemined in gliomas using immunohistochemistry (Envision method).. The correlation was analyzed between expression of IMP3, Ki-67 and malignant degree of gliomas. And the correlation between the expression of IMP3 and Ki-67 was also analyzed.ResultsThe expression of IMP3 in different grade gliomas was statistically significant (χ2=41.17,P<<0.05) and it was significantly higher in grade Ⅲ-Ⅳ gliomas than that in gradeⅠ-Ⅱ (91.4% vs. 8%, χ2=41.34,P<0.05). The range of Ki-67LI was 0%-50%. The expression of Ki-67 in different grade gliomas was statistically significant(χ2=29.80,P<0.05) and it was significantly higher in grade Ⅲ-Ⅳ gliomas than that in gradeⅠ-Ⅱ(91.4% vs. 20%, χ2=50.29,P<0.05). There was positive correlation between IMP3 and Ki-67 expression in brain gliomas (r=0.774,P<0.05).ConclusionThe expression of IMP3 and Ki-67 in gliomas was positive correlated with the grades of gliomas. The united application of them can be used as important reference index for evaluation of gliomas's biological behavior.

Insulin-like growth factor Ⅱ mRNA-binding protein 3; Nuclcear- associated antigen Ki-67; Brain glioma

* [基金項(xiàng)目]濟(jì)寧市科技局2012年計(jì)劃內(nèi)科研項(xiàng)目(編號：2012 jnwk04)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.01.007

R363.2

A

1000-9760(2015)02-028-05

2014-12-11)