李運(yùn)清

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067)

·博士論壇·

解脂耶氏酵母研究進(jìn)展

李運(yùn)清

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067)

李運(yùn)清，女，1986年10月生于山東省濟(jì)寧市。2014年畢業(yè)于武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)專業(yè)，獲理學(xué)博士學(xué)位。2009年畢業(yè)于哈爾濱工業(yè)大學(xué)生物工程專業(yè)，工學(xué)學(xué)士。2009-2014年參與國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30871347和31370124)，采用遺傳學(xué)操作手段，運(yùn)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法，在解脂耶氏酵母中成功的找到了一些控制出芽位點(diǎn)選擇的關(guān)鍵基因，并通過(guò)對(duì)這些基因的功能和相互關(guān)系的研究來(lái)探索控制解脂耶氏酵母出芽位點(diǎn)選擇的信號(hào)通路。

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一種需氧的、無(wú)致病性的二型性非常規(guī)酵母。該酵母因其可以有效地利用疏水性底物為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖而得到研究人員的關(guān)注。與模式生物釀酒酵母相比，解脂耶氏酵母表現(xiàn)出很多特殊的生理、代謝以及基因水平上的特性，這些特性使得很多研究小組以該酵母為模式生物進(jìn)行了一系列的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，并取得了很多非常有價(jià)值的研究成果。本文就解脂耶氏酵母中一些基礎(chǔ)理論的研究現(xiàn)狀以及其在污染物的處理和工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

解脂耶氏酵母；選擇性剪接；二型性；疏水底物；污染物

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一種非常規(guī)酵母，屬于半子囊菌綱(Hemiascomycetes)、耶氏酵母菌屬。該酵母在自然界中分布廣泛，主要集中在富含脂類和蛋白質(zhì)的環(huán)境中，如地溝油、奶酪、采油井口等，這種分布特點(diǎn)與其有較高的分解疏水性底物的能力相關(guān)[1-2]。解脂耶氏酵母因其獨(dú)特的生理和代謝方式，引起了廣大研究者的興趣。隨著其全基因組測(cè)序的完成，一系列分子生物學(xué)和遺傳學(xué)相關(guān)平臺(tái)相繼建立，對(duì)該酵母的研究也日益更新，有越來(lái)越多的學(xué)術(shù)論文及科研成果被發(fā)表出來(lái)(圖1)。

目前對(duì)解脂耶氏酵母的研究主要集中在基礎(chǔ)理論研究和工業(yè)應(yīng)用研究?jī)蓚€(gè)方面?；A(chǔ)理論研究主要包括以下幾個(gè)方面：基因組的結(jié)構(gòu)和選擇性剪接，細(xì)胞的二型性轉(zhuǎn)換、脂肪酶的合成和分泌等。在工業(yè)應(yīng)用方面的研究主要包括生物脂質(zhì)的生產(chǎn)、有機(jī)酸的生產(chǎn)以及對(duì)廢棄物和污染物的處理等。本文將從這幾個(gè)方面逐一進(jìn)行介紹。

圖中所列為1984年至2014年間，在PubMed中以Yarrowia lipolitica為關(guān)鍵字進(jìn)行搜索，每一年中所能找到的文章的數(shù)目。

1 解脂耶氏酵母中的基礎(chǔ)理論研究

1.1 基因組的結(jié)構(gòu)和選擇性剪接

解脂耶氏酵母的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，共有6條染色體，基因組全長(zhǎng)為20.5 Mb，G+C含量為49%。通過(guò)分析其基因組發(fā)現(xiàn)該酵母的基因組不屬于典型的子囊菌綱酵母菌的基因組，而是有其特異性的。與其它的酵母菌相比，解脂耶氏酵母的基因組中存在特異的染色體復(fù)制起始位點(diǎn)和著絲粒DNA并且含有大量的tRNA基因，此外5s rRNA是隨機(jī)的分散在整個(gè)基因組中的，而不是聚集在某一區(qū)域。以上這些都是解脂耶氏酵母基因組所特有的。目前被研究的相對(duì)較多的是該酵母的基因組中含有大量的內(nèi)含子，這與其他的酵母菌也是不同的。半子囊菌綱的酵母菌基因組中都含有很少的內(nèi)含子，如釀酒酵母中僅含有287個(gè)內(nèi)含子，基因密度為70%，白色念珠菌(Candida albicans)含有415個(gè)內(nèi)含子，基因密度為62%。而解脂耶氏酵母中共含有1119個(gè)內(nèi)含子，基因密度僅為45.8%。

提高基因編碼效率的一個(gè)有效策略就是采用選擇性剪接，將外顯子選擇性的轉(zhuǎn)錄并采用不同方式進(jìn)行排列，這樣就可以編碼出種類更多的蛋白質(zhì)。因此，研究基因的選擇性剪接有著非常重要的實(shí)際意義。但由于一般酵母菌中含有的內(nèi)含子較少，選擇性剪接發(fā)生的頻率也比較低，因此，可用于研究選擇性剪接的模型很少。在這種背景下，含有內(nèi)含子較多的解脂耶氏酵母逐漸吸引了研究者的注意。當(dāng)把解脂耶氏酵母分別在葡萄糖和油酸培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，對(duì)所培養(yǎng)的菌株的cDNA進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)這2種菌株的基因組中含有的內(nèi)含子數(shù)目以及含有內(nèi)含子的基因的數(shù)量均存在差異，這就證明了在解脂耶氏酵母中選擇性剪接存在的可能性[3]。

在解脂耶氏酵母中存在5種常見(jiàn)的選擇性剪接形式，包括內(nèi)含子保留、可變的5’端、可變的3’端、外顯子跳躍以及互斥外顯子。轉(zhuǎn)座子mutyl是第一個(gè)被證明存在選擇性剪接的基因，該轉(zhuǎn)座子通過(guò)可變的5’和3’剪接2種方式編碼4種不同的蛋白。此后又發(fā)現(xiàn)編碼蘋(píng)果酸脫氫酶(參與三羧酸循環(huán))的基因通過(guò)選擇性剪接決定所編碼的蛋白在細(xì)胞中的位置。在釀酒酵母中存在3個(gè)基因MDH1、MDH2、MDH3分別編碼分布在線粒體、細(xì)胞質(zhì)以及過(guò)氧化物酶體中的蘋(píng)果酸脫氫酶。而在解脂耶氏酵母中只存在2個(gè)基因YlMDH1和YlMDH2，其中YlMDH1編碼位于線粒體中的蘋(píng)果酸脫氫酶，而YlMDH2則通過(guò)內(nèi)含子可變的3’端剪接分別編碼分布于細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化氫酶體中的蘋(píng)果酸脫氫酶[4]。通過(guò)這種方式解脂耶氏酵母在三羧酸循環(huán)途徑中節(jié)省了一個(gè)基因，這也是選擇性剪接提高基因使用效率的一個(gè)很好的例子。

其它生物中參與調(diào)控選擇性剪接的信號(hào)通路為NMD(nonsense-mediated mRNA decay)信號(hào)通路，但對(duì)于該信號(hào)通路中的很多調(diào)控因子并不清楚。研究表明在解脂耶氏酵母中同樣存在這條信號(hào)通路參與調(diào)控mRNA的選擇性剪接。解脂耶氏酵母中含有NMD信號(hào)通路中的重要的基因UPF1和UPF2，并且這2個(gè)基因編碼的蛋白均參與調(diào)控mRNA的選擇性剪接，缺失后選擇性剪接不能正常進(jìn)行。但與其它物種不同的是一些NMD信號(hào)通路中的重要基因如UPF3、SMG1、SMG5、SMG6等在解脂耶氏酵母中均未發(fā)現(xiàn)同源基因。這表明解脂耶氏酵母中的NMD信號(hào)通路在進(jìn)化中可能發(fā)生了很大的改變，或者存在其他的信號(hào)通路參與調(diào)控mRNA的選擇性剪接[5]。因此，對(duì)于解脂耶氏酵母基因組和選擇性剪接的研究有助于進(jìn)一步完善對(duì)選擇性剪接的分子調(diào)控機(jī)制的理解，對(duì)其它物種中選擇性剪接的研究有一定的指導(dǎo)意義。

1.2 解脂耶氏酵母的二型性

解脂耶氏酵母是一種二型性酵母，即細(xì)胞形態(tài)可以在酵母型、假菌絲型以及菌絲型之間進(jìn)行相互轉(zhuǎn)換(圖2)。釀酒酵母是最早用來(lái)研究二型性的模式生物，但它只能形成假菌絲，并不能形成真正的菌絲，這就使得它在研究菌絲形成的分子機(jī)制中有一定的局限性。因此，科學(xué)家們逐漸將注意力轉(zhuǎn)移到另外一種二型性酵母白色念珠菌中。該酵母可以形成真正的菌絲，但是由于它只存在二倍體世代，不方便對(duì)其進(jìn)行遺傳學(xué)操作，因此，也在一定程度上制約了對(duì)二型性轉(zhuǎn)換的研究。直到20世紀(jì)90年代，有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母可以作為研究酵母二型性的模式生物，該酵母既存在單倍體世代，又可以形成真正的菌絲。在進(jìn)化程度上解脂耶氏酵母相距釀酒酵母和白色念珠菌都比較遠(yuǎn)，因此，對(duì)于它的二型性轉(zhuǎn)換的研究有助于完善對(duì)真菌二型性的理解。

圖2 解脂耶氏酵母的不同細(xì)胞形態(tài)

解脂耶氏酵母的二型性轉(zhuǎn)換是受外界環(huán)境控制的，生長(zhǎng)溫度，環(huán)境中氧的濃度以及pH值等都會(huì)影響細(xì)胞的菌絲形成能力。目前對(duì)解脂耶氏酵母菌絲形成的分子機(jī)制的研究剛剛起步，還沒(méi)有勾畫(huà)出一個(gè)完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但與釀酒酵母和白色念珠菌中的調(diào)控機(jī)制存在很大不同。在釀酒酵母和白色念珠菌中存在兩條信號(hào)通路參與調(diào)控該過(guò)程：MAPK和c-AMP信號(hào)通路。在釀酒酵母中，Ste11和Ste7均屬于MAPK信號(hào)通路，共同參與促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，但在解脂耶氏酵母中，雖然Ste11的同源蛋白YlSte11促進(jìn)了菌絲生長(zhǎng)，但該信號(hào)通路中的另一成員Ste7的同源蛋白YlSte7并不參與細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程。因此，MAPK信號(hào)通路在解脂耶氏酵母二型性轉(zhuǎn)換過(guò)程中所起的作用目前并不確定。另外，解脂耶氏酵母中與Tpk1(釀酒酵母中cAMP-PKA信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)蛋白)同源的蛋白YlTpk1抑制了菌絲的生長(zhǎng)，這表明在解脂耶氏酵母中該通路對(duì)于菌絲的生長(zhǎng)可能起到一個(gè)抑制的作用。此外，在解脂耶氏酵母中還發(fā)現(xiàn)一些基因參與調(diào)控了細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)換，如Mhy1、Hoy1、YlTec1以及YlRas2都促進(jìn)菌絲的形成，但這些基因之間的關(guān)系以及它們所在的調(diào)控通路目前并不清楚[6-7]。因此，對(duì)于解脂耶氏酵母的二型性的研究有待進(jìn)一步地加深，并且該過(guò)程是一個(gè)高度極性化的過(guò)程，這對(duì)于我們理解其他生物的極性化過(guò)程也有一定的指導(dǎo)意義。

1.3 脂肪酶的合成研究

脂肪酶是一類絲氨酸水解酶，可以促進(jìn)長(zhǎng)鏈三酰甘油中酯鍵的水解，將其分解成脂肪酸以及丙三醇。解脂耶氏酵母有很強(qiáng)的分解脂肪的能力，在富含脂質(zhì)的培養(yǎng)基上可以觀察到菌落周?chē)黠@的水解圈，這表明該酵母可以分泌產(chǎn)生大量的脂肪酶類[1]。

解脂耶氏酵母中脂肪酶產(chǎn)生的量與該酵母生長(zhǎng)時(shí)所利用的碳源和氮源是直接相關(guān)的。當(dāng)培養(yǎng)基中含有豐富的碳源如葡萄糖、丙三醇時(shí)，細(xì)胞不產(chǎn)生脂肪酶；當(dāng)培養(yǎng)基中含有含氮的無(wú)機(jī)物如NH4Cl、(NH4)2SO4時(shí)抑制脂肪酶的產(chǎn)生；當(dāng)培養(yǎng)基中碳源缺乏且有含氮有機(jī)物如甲酯、脂肪酸存在時(shí)，細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的脂肪酶。這可能是由于葡萄糖的代謝過(guò)程中某些中間產(chǎn)物對(duì)脂肪酶的合成有一定的抑制作用。在一株脂肪酶產(chǎn)量非常高的解脂耶氏酵母突變體LgX64.8中，己糖激酶活性降低導(dǎo)致其對(duì)葡萄糖和果糖的代謝能力下降，而產(chǎn)生的脂肪酶含量高達(dá)174 U/ml，是野生型菌株的100倍。當(dāng)在該突變體中過(guò)量表達(dá)HXK基因(增加己糖激酶含量)，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪酶含量降低，這表明解脂耶氏酵母中糖類代謝過(guò)程的某些中間產(chǎn)物可能抑制了脂肪酶的產(chǎn)生和分泌[8]。

解脂耶氏酵母中共含有16個(gè)編碼脂肪酶的同源基因，但目前對(duì)這16個(gè)基因的研究比較少，只有LIP2、LIP7以及LIP8 3個(gè)基因被證明參與了脂肪酶的合成。微陣列數(shù)據(jù)分析表明在脂肪酶合成過(guò)程中只有部分基因被表達(dá)，敲除其中一個(gè)或兩個(gè)基因并不能完全消除脂肪酶的產(chǎn)生，只有當(dāng)3個(gè)基因全部缺失后，細(xì)胞才會(huì)喪失合成脂肪酶的能力。因此，這3個(gè)基因在調(diào)控脂肪酶的合成中可能起到一個(gè)協(xié)同作用，在不同的信號(hào)通路中發(fā)揮作用。目前，LIP2基因的結(jié)構(gòu)和功能被研究得比較多，晶體學(xué)研究表明在Lip2p的活性位點(diǎn)上含有兩個(gè)短的α-螺旋，這2個(gè)α-螺旋可以把活性位點(diǎn)緊緊地鎖定在疏水基質(zhì)的表面，使界面活化，進(jìn)而催化水解反應(yīng)的進(jìn)行。LIP2編碼的脂肪酶的合成過(guò)程也受到基質(zhì)中間代謝產(chǎn)物的影響，如油酸的積累可以減少脂肪酶的產(chǎn)生，而丙三醇的含量則影響不大[9-10]。

2 解脂耶氏酵母的應(yīng)用研究

解脂耶氏酵母可以利用眾多的廉價(jià)材料為底物并且可以分泌產(chǎn)生很多有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的代謝產(chǎn)物。本部分僅從以下4個(gè)方面闡述目前解脂耶氏酵母在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的發(fā)展現(xiàn)狀。

2.1 在污染物處理中的應(yīng)用

解脂耶氏酵母有非常強(qiáng)的分解疏水性底物的能力，它可以有效地降解硝基、鹵化物以及有機(jī)磷酸鹽等污染物，因此，被廣泛應(yīng)用于一些污染物的處理中。隨著化工炸藥在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，一些化工炸藥如2,4,6-三硝基甲苯(TNT)已經(jīng)成為污染土壤、地表水以及地下水的主要污染源，但可以有效降解化工炸藥的微生物卻比較少。解脂耶氏酵母能夠有效地降解這種硝基芳香族化合物，它通過(guò)還原硝基或者是解開(kāi)苯環(huán)結(jié)構(gòu)來(lái)解除該化合物的毒性，從而消除污染。目前，共分離得到了4株可以有效降解TNT的解脂耶氏酵母菌株，它們可以將TNT降解成為無(wú)毒的硝酸鹽，這些硝酸鹽可以作為硝化細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步完成氮元素的循環(huán)[11-12]。

一些重金屬離子如銅、鈷、鎳、汞等通過(guò)污染土壤以及水源，威脅人類的健康。解脂耶氏酵母可以耐受并且吸附重金屬離子從而消除它們對(duì)環(huán)境的污染。重金屬離子可以通過(guò)抑制酶的活性從而阻止細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而殺死細(xì)胞。解脂耶氏酵母對(duì)抗重金屬離子的機(jī)制有4個(gè)方面：1)可以將重金屬離子阻擋在細(xì)胞壁外，防止其對(duì)細(xì)胞造成傷害；2)有相應(yīng)的外排系統(tǒng)，可以有效地將重金屬離子排出；3)產(chǎn)生更多的金屬結(jié)合蛋白，如黑色素、親金屬蛋白等；4)增加過(guò)氧化物歧化酶(SOD)、H+ATPase等酶類的數(shù)量。以銅離子為例，解脂耶氏酵母中的YlCRF1基因可以編碼銅離子應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，指導(dǎo)合成更多的可以和重金屬離子結(jié)合的蛋白，如親金屬蛋白以及黑色素、SOD等。在黑色素和SOD存在的情況下，解脂耶氏酵母可以耐受6 mM的銅離子，這一特性使其在聚集和結(jié)合銅離子過(guò)程中起著非常重要的作用。另外，解脂耶氏酵母已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成生物吸附劑，被用于吸附鉻離子并取得了很好的效果。在最優(yōu)條件(pH 1.0， 35 ℃，10 rpm)下，2 h就可以達(dá)到吸附平衡。與其它菌株聯(lián)合使用制成的鉻離子的吸附膜也可以得到很好的吸附效果，可使電鍍廠廢水中鉻的含量降低96%。也有一些重金屬離子是解脂耶氏酵母不能耐受的，如鋅和鈷可以殺死該酵母，鎳和鎘對(duì)它也是有毒性的，他們可以與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)合，從而影響細(xì)胞的形態(tài)，使其喪失形成菌絲的能力[13-14]。

一些有機(jī)磷酸酯類的農(nóng)藥如殺蟲(chóng)劑甲基對(duì)硫磷的廣泛使用，使得有機(jī)磷成為污染水和土壤的重要污染源。而解脂耶氏酵母可以有效地分解該化合物并解除毒性。實(shí)驗(yàn)表明將假單胞菌中的MPH基因克隆到解脂耶氏酵母中，構(gòu)成重組菌株。該菌株在最優(yōu)條件下分泌的酶量可達(dá)到59.5 U/mg，并且在30min內(nèi)就可以將90.8%的甲基對(duì)硫磷分解。此外，解脂耶氏酵母對(duì)有毒的鹵化物也有很強(qiáng)的耐受性，并且可以分解部分鹵化物，如氯代十六烷、溴代烷等，但在分解過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)胞變大并且細(xì)胞表面的疏水性加強(qiáng)，這可能是其逃避鹵化物毒性的策略。

除了前面介紹的幾種較難處理的污染物以外，解脂耶氏酵母對(duì)其它的一些廢棄物也有降解轉(zhuǎn)化的功效，可以實(shí)現(xiàn)廢物的再利用。例如，一些農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廢棄物經(jīng)過(guò)解脂耶氏酵母處理后可以變成有用的物品：可以用菠蘿垃圾為底物生產(chǎn)檸檬酸，以含糖量很低的甘蔗渣為底物生產(chǎn)單細(xì)胞油脂等[14]，都是通過(guò)解脂耶氏酵母將垃圾轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的很好的例子，一方面減少了固體污染物的出現(xiàn)，另一方面也創(chuàng)造了很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，加強(qiáng)對(duì)解脂耶氏酵母的研究有助于推動(dòng)污染物的處理及廢棄物再利用的發(fā)展。

2.2 在污水處理中的作用

根據(jù)污水的特性我們可以將其分為含油污水和含固體顆粒污水，而解脂耶氏酵母對(duì)這兩種污水都有很好的處理效果(圖3)。橄欖油榨油廠排出的污水中含有大量的油脂類物質(zhì)，處理此類污水時(shí)一般需要消耗大量的氧氣，而使用解脂耶氏酵母可以降低氧的消耗，使化學(xué)耗氧量降低80%。將解脂耶氏酵母的野生型菌株W29固定化后用于處理榨油廠污水，可以在50 h內(nèi)將含油量為200 mg/L的污水處理完全。如果將一些外源基因如lipRS基因?qū)氲浇庵辖湍钢?，增加其蛋白的錨定位點(diǎn)，可使對(duì)油脂的降解率達(dá)到96.9%～97.6%，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)化效率。解脂耶氏酵母也可以處理一些含固體顆粒的污水，如處理魚(yú)塘廢棄物，降低廢棄物中的脂肪含量，提高蛋白質(zhì)含量，使其成為營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的飼料[14-15]。

圖3 解脂耶氏酵母在污水處理中的應(yīng)用

2.3 生物脂質(zhì)的生產(chǎn)

為了解決石油短缺問(wèn)題，很多科學(xué)家開(kāi)始尋找可以在體內(nèi)存儲(chǔ)大量油脂的產(chǎn)油微生物，利用這些微生物來(lái)生產(chǎn)可以替代傳統(tǒng)的石油能源的新型能源。人們把油脂含量可以達(dá)到自身生物量的20%以上的微生物稱為產(chǎn)油微生物。某些酵母菌的產(chǎn)油量可以到達(dá)生物量的65%以上，解脂耶氏酵母中脂類物質(zhì)的含量可以達(dá)到細(xì)胞干重的40%以上，這與其他一些酵母相比略低。但是解脂耶氏酵母是唯一完成基因組測(cè)序并且具有完整的遺傳操作手段的產(chǎn)油酵母，因此，方便對(duì)其進(jìn)行基因的改造以進(jìn)一步提高其細(xì)胞內(nèi)脂類的含量。

解脂耶氏酵母中含有產(chǎn)油酵母菌所特有的ATP-檸檬酸裂解酶的編碼基因：ACL1和ACL2，因此，可以通過(guò)檸檬酸裂解來(lái)得到乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A是合成脂類物質(zhì)的前體。因此，我們可以通過(guò)提高檸檬酸的含量來(lái)提高乙酰輔酶A的產(chǎn)量，進(jìn)一步提高脂類物質(zhì)的產(chǎn)量。有研究小組通過(guò)提高底物三?；视鸵约按呋噶姿岣视兔摎涿傅暮縼?lái)提高檸檬酸的產(chǎn)量，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步改造β-氧化酶信號(hào)通路，可以將解脂耶氏酵母的產(chǎn)油量達(dá)到整個(gè)生物量的80%，大大高于其他的一些產(chǎn)油酵母。另外，由于解脂耶氏酵母可以利用很多的廉價(jià)底物進(jìn)行生產(chǎn)，可以很大程度的降低成本。此外，解脂耶氏酵母還可以產(chǎn)生很多的不飽和脂肪酸，可以用于單細(xì)胞油脂(single cell-oil，SCO)類的食品生產(chǎn)。例如，富含二十二碳六烯酸(DHA)的SCO可以作為膳食補(bǔ)充劑，還有花生四烯酸、γ-亞麻酸等[16-18]。因此，對(duì)解脂耶氏酵母堆積脂類物質(zhì)的研究有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2.4 檸檬酸的生產(chǎn)

解脂耶氏酵母在富含碳源的培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，如檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸(α-KGA)、丙酮酸及琥珀酸等。早在19世紀(jì)80年代，解脂耶氏酵母就被用于檸檬酸的生產(chǎn)，檸檬酸在飲料生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。由于解脂耶氏酵母可以分解大量的疏水性底物，因此，可以利用很多的廉價(jià)的底物為碳源生產(chǎn)脂肪酸，如未加工的丙三醇(生產(chǎn)生物柴油產(chǎn)生的廢棄物)。一些農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廢棄物也可以作為生產(chǎn)檸檬酸的底物，如使用菊糖塊莖的榨取液為底物生產(chǎn)檸檬酸，產(chǎn)量可以達(dá)到68.3 g/L；以橄欖油榨油廠的廢水為底物生產(chǎn)檸檬酸，產(chǎn)量可以達(dá)到28.9 g/L。因此，用解脂耶氏酵母來(lái)生產(chǎn)檸檬酸既可以降低生產(chǎn)成本又可以解決一些廢棄物的污染問(wèn)題，達(dá)到雙贏的目的。長(zhǎng)久以來(lái)，人們主要通過(guò)改造菌株、改變底物、改變工藝參數(shù)等方法來(lái)提高解脂耶氏酵母中檸檬酸的產(chǎn)量，主要做法如圖4所示。

圖4 提高檸檬酸產(chǎn)量的做法

研究表明在培養(yǎng)基質(zhì)中加入醋酸鹽可以提高檸檬酸的產(chǎn)量，將檸檬酸的產(chǎn)量由0.5 g/L提高到18.7 g/L。一些化學(xué)表面活性劑如Triton X-100可以增強(qiáng)細(xì)胞表面的滲透性，進(jìn)而影響檸檬酸的產(chǎn)量，使產(chǎn)量提高1.4～1.8倍。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，重組菌的應(yīng)用也大大提高了檸檬酸的產(chǎn)量。對(duì)菌株的改造主要從兩方面入手：第一改變代謝途徑，第二增加可用底物的范圍。如將基因組中編碼ATP-檸檬酸裂解酶的基因ACL1敲除并且增強(qiáng)異檸檬酸裂解酶基因的表達(dá)可以很大程度的提高檸檬酸的產(chǎn)量。經(jīng)過(guò)改造后的菌株以10%的菊粉為底物進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，檸檬酸產(chǎn)量可以達(dá)到84.0 g/L，是野生型菌株的10倍。將釀酒酵母中的SUC2基因轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母中能擴(kuò)大可利用的底物范圍[19-20]。以上數(shù)據(jù)表明通過(guò)改造菌株的方法來(lái)提高檸檬酸的產(chǎn)量是非常有效的。

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)解脂耶氏酵母的研究已經(jīng)深入到各個(gè)領(lǐng)域，并且取得了很好的研究成果。除了我們上面介紹到的以外，解脂耶氏酵母還被廣泛應(yīng)用于研究過(guò)氧化物酶體的生物合成、線粒體復(fù)合物I的相關(guān)疾病等領(lǐng)域；并且被用于生產(chǎn)ω3-濃縮油、β-類胡蘿卜素等工業(yè)產(chǎn)品。但目前對(duì)解脂耶氏酵母分子水平上的研究仍然比較缺乏，不利于我們從基因水平上理解該酵母的特性。因此，對(duì)解脂耶氏酵母的研究有待進(jìn)一步的展開(kāi)，其獨(dú)特的生物學(xué)特性將會(huì)給我們帶來(lái)意想不到的發(fā)現(xiàn)。

[1] Nicaud J M.Yarrowia lipolytica[J].Yeast,2012，29:409-418.

[2] Barth G,Gaillardin C.Yarrowia lipolytica.In non-conventional Yeasts in Biotechnology.Wolf K(ed).Springer-Verlag:Berlin,Heidelberg,New York,1996:313-388.

[3] Mekouar M,Blanc-Lecfle I,Ozanne C,et al.Detection and analysis of alternative splicing in Yarrowia lipolytica reveal structural constraints facilitating nonsense-mediates decay of intron-retaining transcripts[J].Genome Biol,2010,11:R65.

[4] Kabran P,Rossignol T,Gaillardin C,et al.Alternative splicing regulates targeting of malate dehydrogenase in Yarrowia lipolytica[J].DNA Res,2012,19(3):231-244.

[5] Nervéglise C,Chalvet F,Wincker P,et al.Mutator-like element in the yeast Yarrowia lipolytica displays multiple alternative splicing[J].Eukaryot Cell,2005,4(3):615-624.

[6] Li M,Li Y Q,Zhao X F,et al.Roles of the three Ras proteins in the regulation of dimorphic transition in the yeast Yarrowia lipolytica[J].FEMS Yeast Res,2014,14:451-463.

[7] Zhao X F,Li M,Li Y Q,et al.The TEA/ATTS transcription factor YlTec1p represses the yeast-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica[J].FEMS Yeast Res,2013,13:50-61.

[8] Fickers P,Nicaud J M,Destain J,et al.Involvement of hexokinase Hxk1 in glucose catabolite repression of LIP2 encoding extracellular lipase in the yeast Yarrowia lipolytica[J].Curr Microbiol,2005,50:133-137.

[9] Goncalves F A,Colen G,Takahashi J A.Optimization of cultivation conditions for extracellular lipase production by Yarrowia lipolitica yeast[J].J African Biotechnol,2013,12:2270-2278.

[10] Fichers P,Marty A,Nicaud J M.The lipases from Yarrowia lipolytica:genetics,production,regulation,biochemical characterization and biotechnological applications[J].Biotechnol Adv,2011,29(6):632-644.

[11] Ziganshin A M,Gerlach R,Borch T,et al.Production of eight different hydride complexes and nitrite release from 2,4,6-trinitro toluene by Yarrowia lipolytica[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(24):7898-7905.

[12] Khilyas I V,Ziqanshin A M,Pannier A J,et al.Effect of ferrihydrite on 2,4,6-trinitrotoluene biotransformation by an aerobic yeast[J].Biodegradation,2013,24(5):631-644.

[13] Bankar A V,Kumar A R,Zinjarde S S.Removal of chromium(VI) ions from aqueous solution by adsorption onto two marine isolates of Yarrowia lipolytica[J].J Hazard Mater,2009,170(1):487-494.

[14] Zinjarde S,Apte M,Mohite P,et al.Yarrowia lipolytica and pollutants:Interactions and applications[J].Biotechnol Advances,2014,32:920-933.

[15] Yano Y,Oilawa H,Satomi M.Reduction of lipids in fish meal prepared from fish waste by a yeast Yarrowia lipolytica[J].Int J Food Microbiol,2008,121(3):302-307.

[16] Koch B,Schmidt C,Daum G.Storage lipids of yeasts:a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae,Pichia pastoris,and Yarrowia lipolytica[J].FEMS Microbiol Rev,2014,38(5):892-915.

[17] Bankar A V,Kumar A R,Zinjarde S S.Environmental and industrial applications of Yarrowia lipolytica[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,84(5):847-865.

[18] Goncalves F A,Colen G,Takahashi J A.Yarrowia lipolytica and its multiple applications in the biotechnological industry[J].Scientific World J,2014,doi:10.1155/2014/476207.

[19] Zinjarde S S.Food-related applications of Yarrowia lipolytica[J].Food Chem,2014,152:1-10.

[20] Souza K S,Schwan R F,Dias D R.Lipid and citric acid production by wild yeasts grown in glycerol[J].J Microbiol Biotechnol,2014,24(4):497-506.

·讀者·作者·編者·

本刊對(duì)作者署名的要求

論著作者署名一般不超過(guò)6人。署中中每位作者應(yīng)該是論文學(xué)術(shù)內(nèi)容的構(gòu)思者或設(shè)計(jì)者；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集并能給予解釋者；能對(duì)編輯部提出的審改意見(jiàn)進(jìn)行修改者；能在學(xué)術(shù)界就論文內(nèi)容進(jìn)行答辯者。綜述作者署名不超過(guò)2人。作者單位、郵政編碼不同者應(yīng)分別列出并予標(biāo)識(shí)，作者單位之間用“；”隔開(kāi)。不夠署名條件但確對(duì)研究成果有所貢獻(xiàn)者可放在“志謝”項(xiàng)中。論文如屬課題或基金項(xiàng)目，須在文章首頁(yè)腳注中注明“基金項(xiàng)目和編號(hào)”。

本刊編輯部

Advances in studies of yarrowia lipolytica

LIYunqing

(Academy of Basic Medicine,Jining Medical University,272067,China)

Yarrowia lipolytica is an aerobiotic,nonpathogenic and dimorphic non-conventional yeast.It is focused due to its ability to efficiently utilize hydrophobic substrates as the sole carbon source.As research continues,this organism exhibits specific physiological,metabolic and genomic characteristics,which differentiate it from the model yeast Saccharomyces cerevisiae.Those properties make many researchers to conduct the basic and applied research of this yeast,and a series of valuable results is obtained.In this paper,we will briefly present the different use of Y.lipolytica for basic knowledge and the advantages gained by exploiting this yeast.

Yarrowia lipolytica;Alternative splicing;Dimorphism;Hydrophobic substrate;Waste

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.01.002

Q93

A

1000-9760(2015)02-008-06

2015-01-09)