那麗莎，劉夕琳，李 想，孫長海

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

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基于生物分子網絡的人參皂苷Rg1的生物效應①

那麗莎，劉夕琳，李 想，孫長海

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：運用代謝組學及生物效應網絡方法研究人參皂苷Rg1的生物效應的機制。方法：采用高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術結合偏最小二乘判別分析方法，考察空白組與人參皂苷Rg1給藥組的內源性物質差異，并確定生物標志物。結果：篩選出對分組貢獻較大的25種潛在生物標記物，通過數據庫確定了6個目標物的結構、代謝途徑，相關酶和作用靶點，分別為吡哆醛與醛氧化酶、氨基葡萄糖和己糖激酶、甲基尿酸及黃嘌呤脫氫酶、多巴醌轉化酪氨酸酶、氟尿苷與胸苷磷酸化酶、卵磷脂和卵磷脂膽固醇?；D移酶。通過網絡藥理學及文獻解釋了人參皂苷Rg1在嘧啶代謝通路中為胸苷磷酸化酶的抑制劑；還可促進卵磷脂通過血漿卵磷脂膽固醇?；D移酶催化成血漿膽固醇酯。結論：代謝組學及生物效應網絡方法能用于人參皂苷Rg1生物效應機制的研究，為進一步揭示人參皂苷Rg1藥理作用機制提供了新方法。

人參皂苷Rg1；代謝組學 ；生物效應網絡

三七為五加科植物[Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen]，是我國傳統(tǒng)的名貴藥材。人參皂苷Rg1(ginsenosideRg1)是三七的主要單體成分，也是臨床應用的藥理活性成分。人參皂苷Rg1具有具有活躍的生物活性，抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、心腦血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)保護作用[1]。研究表明，人參皂苷Rg1可抑制腫瘤細胞蛋白質合成、促進BGC-823細胞凋亡[2]；其影響Caspase-3、Bcl-2的表達，可對腦缺血再關注損傷有明顯保護作用[3]；可明顯抑制TF-1細胞的增值并促進其凋亡，對人白血病TF-1細胞EPOR信號通路具有影響[4]。但是，如何應用生物分子網絡同時探索藥物多種生物效應機制的方法尚未見報道。因此，本研究以代謝組學分析方法研究空白組與人參皂苷Rg1給藥組代謝差異，根據差異性代謝物結合網絡藥理學解釋其相關酶、靶點及代謝途徑，為闡明人參皂苷Rg1引起的多種生物效應機制提供了新方法[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

①實驗動物：選擇清潔級Wistar雄性大鼠12只，體重(200±20)g，購自長春億斯實驗動物技術公司，許可證號：SCXK-(吉)2011-0004； ②儀器與試藥Agilent1200/6300型高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀；KQ-250DE臺式數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；人參皂苷Rg1標準品(大連美侖生物技術有限公司，CAS:22427-39-0)；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；甲酸(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；實驗室用水為自制三蒸水；

1.2 實驗方法

①實驗分組：將大鼠隨機分為空白組與人參皂苷Rg1給藥組。人參皂苷Rg1組以100mg·kg-1劑量隔日灌胃給藥一次，連續(xù)7d?？瞻捉M給予等量的生理鹽水。實驗前，每只大鼠眼眶取0.5mL空白血，實驗時，每只大鼠于1d,3d,5d,7d灌胃給藥1h后取血：取血0.5mL，靜置半小時，于3500r·min-1離心10min，分離血清，-80℃下保存。 ②血清的前處理：取100μL血清樣品，加入200μL甲醇，渦旋30s，于10000r·min-1離心10min，移取上清液，40℃N2流下吹干，殘渣用100μL甲醇復溶，渦旋30s后離心5min，取10μL上清液進樣。 ③實驗條件：色譜條件AgilentBC-C18柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；C18保護柱(5mm×2.1mm，1.7μm)；流動相:(A)0.1%甲酸+5%水+甲醇(B)0.1%甲酸+5%甲醇+水，梯度洗脫(初始0%A，100%B;20min，100%A，0%B;25min，100%A，0%B；30min，0%A，100%B) ；流速：0.6mL·min-1;柱溫：25℃；進樣量為10μL。質譜條件 離子肼ESI源；正離子模式自動二級在m/z50～1000內進行全掃描；毛細管電壓為13V，溫度為350℃；鞘氣(N2)流量為10mL·min-1；輔助氣(N2)流量為0.15mL·min-1；碰撞氣為He。

2 結果

2.1 給藥后大鼠血清總離子流圖

全掃描監(jiān)測的血清的總離子流圖(圖1)。圖1A為空白組，圖1B為給藥組，由圖可知，給予人參皂苷Rg1后引起大鼠血清明顯代謝差異。

圖1A 空白組

圖1B 人參皂苷Rg1給藥組

2.2 模式識別

利用MATLAB程序對色譜峰平滑、對齊、匹配處理，提取碎片的質荷比(50-1000)、保留時間、和相應的峰強度(>10000)。將輸出的三維數據導入SIMCA-P12.0軟件進行中心化和Pareto均一化處理，然后以非監(jiān)督的主成分分析(PCA)，對大鼠血清進行模式識別分析[6]。血清樣本PCA得分圖2所示，1～6號為空白組，7～12號為人參皂苷Rg1給藥組，兩組區(qū)分明顯，說明人參皂苷Rg1影響大鼠體內的代謝發(fā)生了明顯變化。

采用偏最小二乘判別分析方法(PLS-DA)，得出載荷圖3來篩選潛在生物標記物。通過選取VIP(Variableimportancefortheprojection)值并結合載荷矩陣圖來研究每一個變量的偏離程度，從而篩選目標物[7,8]。在載荷圖中，共有280個變量，偏離程度越大并且VIP值>1.5的點為對分組有顯著性貢獻的變量。如圖3，紅色的框標記出對分組有顯著性貢獻的變量，因此，選擇這些25個變量為生物標記物。

圖2 空白組與給藥組的PLS-DA得分圖

圖3 空白組與給藥組的PLS-DA載荷圖

2.3 生物標記物鑒定及生物效應分析

根據提取生物標記物的分子離子峰，得到精確的質荷比(m/z)，代入到ChEBI與HMDB數據庫中搜索可能的化合物，然后結合二級質譜碎片裂解規(guī)律及參考文獻中的MS/MS標準譜圖進行比對，最后鑒定出6種目標物結構，分別為吡哆醛m/z167.1、氨基葡萄糖m/a179.0、甲基尿酸m/z182.0、多巴醌m/z195.1，氟尿苷m/z246.2，卵磷脂m/z494.3。

采用KEGG網站及相關文獻分析目標物的相關酶，代謝途徑及相關疾病的生物效應，見表1。

表1 生物標志物及其代謝通路

3 討論

人參皂苷Rg1是從三七中分離出的單體成分，具有活躍的生物活性，其對心血管系統(tǒng)[9]、免疫系統(tǒng)[10]、神經系統(tǒng)[11]的保護以及明顯的抗腫瘤[12]、抗肝炎[13]作用已受到廣泛關注。迄今為止，同時揭示人參皂苷Rg1的多種作用機制未見報道。本研究采用液質聯(lián)用技術結合模式識別PLS-DA，對人參皂苷Rg1給藥組和空白組大鼠的血清進行分析，研究兩組大鼠的體內代謝差異。PLS-DA屬于有監(jiān)督模式的識別方法，并且具有較強的分類能力。結果顯示，PLS-DA法能有效的將人參皂苷Rg1給藥組和空白組區(qū)分開，根據VIP>1.5的為生物目標物，并通過生物分子網絡鑒定了吡哆醛、甲基尿酸、多巴醌、氟尿苷、氨基葡萄糖、卵磷脂6個差異代謝物。KEGG數據庫為代謝物從代謝途徑的水平理解細胞或組織的生物學意義提供了生物信息資源。但由于數據庫的信息還不是很完整，結合相關文獻只闡述了2條代謝通路及作用機制，但其他內源性代謝物的變化也為后續(xù)的研究提供了依據。

分析嘧啶代謝通路可知，胸苷磷酸化酶(TP)在氟尿苷的參與下轉化為胸苷激酶。TP是嘧啶代謝及DNA合成的關鍵酶 ，通過參與細胞信號傳導來促進癌細胞生長同時抑制正常細胞凋亡[14]。研究表明，在腫瘤組織中，TP的表達明顯高于正常組織，尤其在血漿中，高出20倍[15]。在此通路中，TP的異常表達引起直腸癌。根據其代謝過程可知，目標代謝物氟尿苷下調，而其上游物只為TP，說明給予人參皂苷Rg1后TP處于抑制狀態(tài)，使其在血清中轉化為氟尿苷的水平下調，而發(fā)揮選擇性細胞抑制作用，TP含量降低可抑制腫瘤和細胞凋亡，以上結論反映出人參皂苷Rg1可作為TP的抑制劑，明確了人參皂苷Rg1預防和治療腫瘤的作用機制。

在卵磷脂膽固醇酰基轉移酶缺乏疾病通路中，卵磷脂通過血漿卵磷脂膽固醇?；D移酶(LCAT)催化形成血漿膽固醇酯。LCAT由肝臟合成后釋放入血，在血漿中由高密度脂蛋白中載脂蛋白A激活。在此酶催化下，血漿游離膽固醇轉化為膽固醇酯和溶血卵磷脂。研究表明，肝臟疾病時由于肝細胞損傷使LCAT合成減少，導致血漿游離膽固醇轉變?yōu)槟懝檀紲p少。血漿LCAT活力高低在肝臟病變中具有重要臨床意義[16]。在此通路中，LCAT與膽固醇酯缺乏癥有關，進一步分析通路可知，卵磷脂下調直接導致LCAT的缺乏，由于藥物對大鼠體內代謝有干預作用，使代謝物卵磷脂上調，可說明該藥物是LCAT的激動劑，LCAT激活可使血漿膽固醇酯增高，從而抑制肝臟疾病。本研究工作證明，人參皂苷Rg1灌胃對正常大鼠機體代謝產生影響，更在生物分子網絡調控的層面闡釋了人參皂苷Rg1的作用機制，對于同時探討藥物的多種生物效應機制提供了新方法。

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佳木斯大學研究生創(chuàng)新項目，編號：XSYD2014-021。

那麗莎(1988～)女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生。

孫長海(1974～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，碩士研究生導師。E-mail:schai1974@sohu.com。

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1008-0104(2015)03-0030-03

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