劉曉曉,余燕,邵營(yíng)格,陳新武,尹飛,陶換,馬金友

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

雛雞感染IBDV后法氏囊組織結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化

劉曉曉,余燕,邵營(yíng)格,陳新武,尹飛,陶換,馬金友

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

為了探究傳染性法氏囊病毒（IBDV）感染后不同時(shí)間點(diǎn)雞法氏囊的病理組織學(xué)變化,用實(shí)驗(yàn)室保存的IBDV（編號(hào)：19951128）感染19日齡雛雞150只,分別在感染后0 h,12 h,24 h,48 h,72 h,96 h,120 h,144 h,168 h, 192 h,33 d隨機(jī)選取6只,采集法氏囊制作石蠟切片,經(jīng)HE染色,觀察法氏囊組織的結(jié)構(gòu)變化并用IPP軟件統(tǒng)計(jì)法氏囊濾泡的面積.結(jié)果顯示：IBDV感染的雞法氏囊組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,即感染早期,法氏囊以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主,隨后B淋巴細(xì)胞崩解,濾泡顯著變小,耐過的雞法氏囊濾泡修復(fù)后不能達(dá)到感染前的水平.

法氏囊；傳染性法氏囊病毒；雞；組織結(jié)構(gòu)

傳染性法氏囊病毒病（IBD）是由雞傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的急性、高度接觸性、以B淋巴細(xì)胞壞死為特征的傳染病.IBDV主要侵害3～6周齡雛雞中樞免疫器官——法氏囊,由于感染此病的雛雞B細(xì)胞大量死亡,造成嚴(yán)重的長(zhǎng)期的免疫抑制,雛雞易感染其他傳染病和疫苗接種失敗,是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一[1-2].目前,IBD已經(jīng)遍布全球養(yǎng)禽地區(qū),在工業(yè)化養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家尤為嚴(yán)重,據(jù)調(diào)查,美國(guó)雞群血清陽性率幾乎100%,南美洲約90%,荷蘭88%,意大利76%,日本75%,德國(guó)61.5%[3].現(xiàn)在IBD在我國(guó)已經(jīng)傳遍各地,某些地方發(fā)病率高達(dá)80%,致死率在30%～70%[4].關(guān)于雞的法氏囊被法氏囊病毒感染后出現(xiàn)發(fā)炎、壞死、萎縮以及法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損的病理變化已有報(bào)道[5].然而,有關(guān)雛雞感染法氏囊病毒后不同時(shí)間點(diǎn)法氏囊組織的動(dòng)態(tài)病理變化報(bào)道較少.本文采用組織切片、HE染色技術(shù)對(duì)病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)的法氏囊進(jìn)行病理組織學(xué)觀察,為該病的預(yù)防提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在新鄉(xiāng)市大用種雞孵化廠購(gòu)買1日齡白來航健康雛公雞150只,置于河南科技學(xué)院實(shí)訓(xùn)中心飼養(yǎng)室喂養(yǎng),雛雞隨機(jī)分為兩組,一組為試驗(yàn)組,另一組為對(duì)照組.

1.2 病毒感染

飼養(yǎng)2周后測(cè)其母源抗體水平,在母源抗體消失后用實(shí)驗(yàn)室保存的IBDV（編號(hào)：19951128）10倍稀釋為200 μL.分別通過點(diǎn)眼（50 μL）、滴鼻（50 μL）和肛門吸收（100 μL）感染小雞10只,3 d后收集感染小雞的法氏囊稱質(zhì)量,按5 g加1 mL PBS（pH 7.36）放冰浴中充分勻漿,離心后收集上清,用PCR檢測(cè)病毒含量,調(diào)整濃度進(jìn)行試驗(yàn)組小雞的感染,感染量和部位與前面相同,感染時(shí)間為19日齡.感染組和未感染IBDV組各70只分開飼養(yǎng),每籠10只.

1.3 病料收集與處理

分別于感染的0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、33 d試驗(yàn)組和對(duì)照組各隨機(jī)拿取6只雞,麻醉后靜脈放血,然后取法氏囊,用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定,采用石蠟切片、HE染色制作組織切片.每只雞的法氏囊選取5張切片,利用Olympus顯微照相系統(tǒng)拍照觀察,并用IPP（Image-Pro Plus software 6.0）軟件測(cè)量法氏囊濾泡的大小.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

全部數(shù)據(jù)用SAS software（version 8.01；SAS Institute,Cary,NC）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多重比較（post hoc test）,所有數(shù)據(jù)用mean±SD表示,以P≤0.05為差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化

雛雞感染法氏囊病毒24 h到48 h,剖檢后可見法氏囊充血水腫,體積增大（圖1-A）.隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)（72～122 h）,法氏囊體積逐漸變小,質(zhì)地變硬（圖1-B）.

圖1 雛雞感染法氏囊病毒后法氏囊的剖檢變化Fig.1 Anatomical changes in bursa of Fabricius of chicken infected with IBDV

2.2 病理變化

光學(xué)顯微鏡下,法氏囊病毒感染的0 h,雛雞法氏囊有許多密集排列的腔上囊小結(jié),囊小結(jié)呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形,平均面積約61 188.13±21 960.67 μm2.小結(jié)間的界限清晰（圖2-A,圖3）.法氏囊病毒感染12 h后,法氏囊中的毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,組織水腫,囊小結(jié)之間的間質(zhì)增寬并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2-B）,但法氏囊囊小結(jié)的面積與感染0 h相比,差異不顯著（58 413.21±25 827.11；P＞0.05）（圖3）.法氏囊病毒感染24 h后,法氏囊組織水腫更甚,囊小結(jié)髓質(zhì)中有壞死的淋巴細(xì)胞,其胞核濃縮,著色加深（圖2-C）,囊小結(jié)面積與感染0 h相比差異仍不顯著（56 383.29±24 106.57；P＞0.05）（圖3）.法氏囊病毒感染48 h和72 h后,法氏囊濾泡間結(jié)締組織大量增生,囊小結(jié)髓質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞大量壞死,不僅表現(xiàn)為核固縮,而且部分淋巴細(xì)胞核碎裂、崩解消失,留下上皮樣細(xì)胞構(gòu)成的網(wǎng)眼,在顯微鏡下呈空泡樣,皮、髓質(zhì)之間界限不清,而且囊小結(jié)面積急劇減?。▓D2-D、E）,與感染0 h相比分別減少了33.9%和38.3%（48 h：40 446.92±11 380.33；72 h：37 527.83±13 429.03；P＜0.05）（圖3）.感染96 h后,法氏囊濾泡皮質(zhì)部淋巴細(xì)胞大量壞死崩解消失,只剩均質(zhì)紅染的物質(zhì)（圖2-F）.此時(shí),法氏囊受損最嚴(yán)重,濾泡面積繼續(xù)變小（16 358.5±6 213.6）,顯著低于48 h和72 h的濾泡面積（P＜0.05）（圖3）.間質(zhì)中結(jié)締組織和淋巴細(xì)胞增生.感染120 h后,法氏囊濾泡間結(jié)締組織.淋巴細(xì)胞和髓質(zhì)區(qū)的網(wǎng)狀上皮細(xì)胞大量增生,所以濾泡與結(jié)締組織間界限不清晰.而上皮樣網(wǎng)狀細(xì)胞彼此間借突起相連構(gòu)成,網(wǎng)眼內(nèi)是壞死崩解的淋巴細(xì)胞,因此有少量淡染的紅色物質(zhì).法氏囊濾泡皮質(zhì)區(qū)域開始出現(xiàn)少量結(jié)構(gòu)完整的淋巴細(xì)胞,濾泡面積略有增加（圖2-G）,為18 815.08±8 192.89,與感染96 h相比,差異不顯著（P＞0.05）（圖3）.網(wǎng)狀支架感染144 h后,法氏囊濾泡的皮質(zhì)部淋巴細(xì)胞大量增生,而且囊小結(jié)的間質(zhì)成分減少,但是彌散大量淋巴細(xì)胞,髓質(zhì)部分變化不明顯（圖2-H）,此時(shí)的囊小結(jié)輪廓較清晰,平均面積與感染96 h相比差異不顯著（19 047.38±3 925.26；P＞0.05）（圖3）.感染168和192 h后,囊小結(jié)的數(shù)量明顯增加,多成圓形,皮質(zhì)區(qū)恢復(fù)較好,髓質(zhì)內(nèi)也開始出現(xiàn)結(jié)構(gòu)完好的淋巴細(xì)胞,但依然存在大量空泡（圖2-I）,但是此時(shí)的囊小結(jié)面積與感染96 h,120 h,144 h相比差異不顯著（168 h：19 200.96±3 950.21；192 h：23 550.42±3 874.08；P＞0.05）（圖3）.濾泡間結(jié)締組織大量增生,所以間質(zhì)成分變得致密.感染33 d后,法氏囊濾泡結(jié)構(gòu)清晰,3層分界明顯,而且排列緊密,髓質(zhì)中網(wǎng)狀支架的網(wǎng)眼內(nèi)填充大量淋巴細(xì)胞,髓質(zhì)部分也恢復(fù)較好.另外間質(zhì)成分中的淋巴細(xì)胞大量減少,基本恢復(fù)正常（圖2-J）,濾泡面積與96 h、120 h、144 h、168 h和192 h相比明顯增高（33 919.5± 9 652.85；P＜0.05）（圖3）.

圖2 法氏囊病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)法氏囊病理組織學(xué)觀察Fig.2 Pathological histology of bursa of Fabricius at different time points after chicken infected with IBDV

圖3 法氏囊病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)法氏囊濾泡面積Fig.3 Area of bursal follicle at different time points after chicken infected with IBDV

3 結(jié)論與討論

法氏囊是禽類所特有的免疫器官,與體液免疫密切相關(guān),且其免疫功能只出現(xiàn)在生命的最初幾周[6].而機(jī)體的特異性免疫包括B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫.IBDV主要在B淋巴細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,所以當(dāng)雞群感染IBDV后其體液免疫將嚴(yán)重受阻,而隋欣等研究證明IBDV侵染雛雞后T細(xì)胞的數(shù)量也大量降低,細(xì)胞免疫也受到抑制,從而引起繼發(fā)感染[7].本研究結(jié)果顯示IBDV感染初期,法氏囊組織充血,水腫,結(jié)締組織增生以及大量的浸潤(rùn)性T細(xì)胞出現(xiàn),這種浸潤(rùn)性的T細(xì)胞在病毒感染后的前5天對(duì)于抑制病毒復(fù)制和清除病毒粒子起著重要作用[8],但T細(xì)胞在法氏囊中的活化導(dǎo)致大量細(xì)胞因子如IL-10、IL-2、IL-4和IFN-γ的上調(diào)[9],造成了法氏囊的組織損傷,減緩了法氏囊濾泡的修復(fù)[8],對(duì)該病的防治增加了難度.研究結(jié)果還表明,IBDV主要侵害囊小結(jié)髓質(zhì)區(qū),其次才是皮質(zhì)區(qū),由于囊小結(jié)髓質(zhì)區(qū)主要是大中型淋巴細(xì)胞,而皮質(zhì)區(qū)主要是中小型淋巴細(xì)胞,可見,IBDV主要侵害大中型淋巴細(xì)胞,其次才是中小型淋巴細(xì)胞,這可能是因?yàn)榇笾行土馨图?xì)胞主要分泌sIgM,而帶有sIgM的B淋巴細(xì)胞是IBDV重要的靶細(xì)胞[10].研究還發(fā)現(xiàn),對(duì)IBD耐過的雞群法氏囊濾泡修復(fù)以后,濾泡的大小仍然不能達(dá)到未感染前的水平,如何進(jìn)一步修復(fù)法氏囊組織尚需進(jìn)一步研究.

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（責(zé)任編輯：盧奇）

Dynamic structural variation in bursa of Fabricius of chicken infected with IBDV

Liu Xiaoxiao,Yu Yan,Shao Yingge,Chen Xinwu,Yin Fei,Tao Huan,Ma Jinyou
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

To explore the changes of histological structure in bursa of chicken infected IBDV （infectious bursal disease virus）,one hundred fifty 19-day-old chickens were infected with the standard strains of IBDV saved in our laboratoyry （number：19951128）.Bursal tissue of 6 chickens was collected at 0 h,24 h,48 h,72 h,96 h,120 h,144 h, 168 h,192 h,33 d after infecting IBDV.Paraffin section and HE staining were performed to investigate structural variation in bursa of fabricius,and IPP software was used to calculating area of bursal.The results suggested that：tissue structure of bursa of Fabricius in IBDV infected chicken presents the dynamic variation,at the early stage of infection,bursa of Fabricius is given priority to with inflammatory cells infiltration,subsequently,B lymphocyte disintegration,follicle significantly smaller,resistance to chicken bursa of Fabricius of follicular cannot achieve the level before infection after repair.

bursa of Fabricius；infectious bursal disease virus；chicken；the organizational structure

S858.31

A

：1008-7516（2015）04-0040-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2015.04.008

2015-03-26

河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計(jì)劃（13HASTIT006）；河南科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2014CX041）

劉曉曉（1993―）,河南駐馬店人,本科生.

馬金友（1968―）,男,河南信陽人,博士,副教授.主要從事分子病理學(xué)與動(dòng)物病原學(xué)研究.