萬 楠，王 璐，孟冬婭，鄭 偉，胡曉芳

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110016)

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·論 著·

血漿miR-324-5p對(duì)單純性先天性心臟病預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)的評(píng)估

萬 楠，王 璐，孟冬婭，鄭 偉，胡曉芳△

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110016)

目的 研究單純性先天性心臟病(CHD)患者血漿miR-324-5p表達(dá)變化，評(píng)價(jià)其在CHD預(yù)后和風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)等方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2012年1月至2013年1月沈陽軍區(qū)總醫(yī)院先天性心臟病內(nèi)科收治的CHD患兒76例為CHD組，另選取13例健康者血清標(biāo)本為對(duì)照組，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測血漿中miR-324-5p的表達(dá)變化，通過Kalpan-Meier生存分析、Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型等綜合評(píng)價(jià)血漿miR-324-5p在CHD預(yù)后和風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)等方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果 與對(duì)照組相比，單純性CHD患者外周血漿miR-324-5p表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Kaplan-Meier生存分析表明，miR-324-5p表達(dá)水平較高組患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及死亡概率更高(P<0.05)；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析表明，在單因素分析中，miR-324-5p表達(dá)水平和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)是CHD的發(fā)病危險(xiǎn)因子(P<0.05)，風(fēng)險(xiǎn)比(HR)分別為1.79和2.17；在多因素分析中，只有BMI是CHD的發(fā)病危險(xiǎn)因子(P<0.05)，HR為1.38，HR 95%置信區(qū)間(CI)為(1.12，1.79)。結(jié)論 血漿miR-324-5p作為CHD診斷的生物學(xué)標(biāo)志物具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但還需要與其他指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用。

先天性心臟病； miR-324-5p； 預(yù)后

先天性心臟病(CHD)是一種常見的先天畸形，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其在新生兒中的發(fā)病率為1.25%[1]。盡管目前相關(guān)檢測和治療手段已經(jīng)提高，但是CHD引起的死亡仍占新生兒死亡的3%，占先天畸形死亡的46%[2]。目前對(duì)CHD的治療以手術(shù)為主，這不僅給患兒及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且近50%的患兒面臨著再次手術(shù)、心律失常及心力衰竭等問題[3-6]。因此，對(duì)CHD患者的預(yù)后判斷和風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)尤為重要，盡早地對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)患者進(jìn)行相關(guān)治療，對(duì)提高患者的生存率和生活質(zhì)量有著重要意義。miR-324-5p位于17染色體短臂1區(qū)3帶1亞帶(17p13.1)，編碼于?；o酶A脫氫酶第35個(gè)內(nèi)含子并與其共轉(zhuǎn)錄。以往關(guān)于miR-324-5p的研究多集中于腫瘤，近期的研究指出循環(huán)系統(tǒng)miR-324-5p可用于診斷心力衰竭，提示miR-324-5p與心血管系統(tǒng)密切相關(guān)。因此，本研究通過檢測外周血清miR-324-5p來闡明CHD的疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并為治療及預(yù)后提供有價(jià)值的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2013年1月本院先天性心臟病內(nèi)科收治的76例單純性CHD患者為CHD組；另選取本科健康者13例為對(duì)照組，所有單純性CHD患者均具有典型的臨床表現(xiàn)，且經(jīng)心臟超聲和手術(shù)確診。

1.2 方法 所有患者于入院前抽取靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，3 000 r/min離心15 min，分離血漿于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 血漿微RNA(miRNA)的提取 采用天根生化(北京)科技有限公司RNAprep pure Tissue Kit試劑盒(批號(hào)DP121221)進(jìn)行血漿miRNAs提取，提取的miRNAs于-70 ℃保存以防止降解。

1.2.2 miR-324-5p反轉(zhuǎn)錄 采用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄方法進(jìn)行miR-324-5p反轉(zhuǎn)錄。莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA CCA AT-3′；反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。應(yīng)用TaKaRa Real-Time PCR試劑盒，以U6為內(nèi)參照基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，正向引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGC GCA TCC CCT AGG GC-3′；反向引物：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′；內(nèi)參基因U6-sense：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；U6-antisense：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在ABI Prism 7500型高通量熒光定量儀(美國ABI公司)上進(jìn)行，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40次，95 ℃ 5 s。反應(yīng)結(jié)果采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清中miR-324-5p的表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，CHD患者外周血漿miR-324-5p表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為兩組血漿miR-324-5p相對(duì)表達(dá)水平，與CHD組比較，aP<0.05；B為實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。

圖1 CHD患兒與對(duì)照組血漿miR-324-5p 表達(dá)情況

2.2 Kalpan-Meier生存分析 以miR-324-5p表達(dá)水平的中位數(shù)0.157為標(biāo)準(zhǔn)將CHD患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組。在1年的隨訪中，由于各種原因造成失訪的患者11例，其余CHD患者中發(fā)生死亡3例，肺動(dòng)脈高壓4例，心律失常8例，心力衰竭4例，肺炎2例。對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，miR-324-5p表達(dá)水平較高的患者將承受更多的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及較高的死亡概率(χ2=4.456，P=0.035)。

2.3 CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分析 CHD組與對(duì)照組的患兒年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血紅蛋白與血小板水平及miR-324-5p表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。將以上因素代入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析，單因素分析發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p表達(dá)水平和BMI都是CHD的發(fā)病危險(xiǎn)因子，風(fēng)險(xiǎn)比(HR)分別為1.79(P=0.046)和2.17(P<0.01)；但在多因素分析中，只有BMI是CHD的發(fā)病危險(xiǎn)因子(P=0.021)，HR為1.38，HR 95%置信區(qū)間(CI)為(1.12，1.79)。見表2。

表1 兩組基本資料比較或n(%)]

注：amiR-324-5p表達(dá)水平用2-ΔCt中位數(shù)表示，2-ΔCt=2-(Ct miR-324-5p- CtU6)。

表2 CHD發(fā)病危險(xiǎn)因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型單因素分析

注：amiR-324-5p表達(dá)水平用2-ΔCt中位數(shù)表示，2-ΔCt=2-(Ct miR-324-5p- CtU6)。

3 討 論

miRNAs是一類內(nèi)源性的、非編碼的小分子(18～24個(gè)核苷酸)RNA，通過與靶基因3 -UTR互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)。miRNAs的表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，在心臟發(fā)育、骨骼肌增殖分化和腫瘤疾病中都起著重要的作用[7-9]。細(xì)胞內(nèi)miRNAs水平異常表達(dá)已被證實(shí)與許多心血管疾病，如心力衰竭、心肌肥大及心血管重塑等密切相關(guān)。一些miRNAs在心血管組織中高表達(dá)，它們?cè)谡{(diào)控心血管的發(fā)育和疾病方面具有重要意義，這給CHD的診斷和治療帶來了希望[10-12]。早期的miRNAs研究主要集中于組織或細(xì)胞，在臨床上無法用于CHD的診斷。近幾年的研究表明，人外周血清中也存在豐富的miRNAs，并且十分穩(wěn)定，能抵抗RNA酶降解，并可以抵御酸、堿和高溫等不良環(huán)境，室溫放置一周仍穩(wěn)定。這使得血清miRNAs具備了常規(guī)檢測指標(biāo)的基本條件。同時(shí)在疾病狀態(tài)下，血液循環(huán)中的miRNAs主要來自患病的組織細(xì)胞的主動(dòng)分泌，并通過外泌體、微小體等載體傳送到微循環(huán)中的免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或其他的受體細(xì)胞中，進(jìn)而影響這些受體細(xì)胞的功能。

以往研究miR-324-5p多集中于腫瘤，而Ellis等[13]提出循環(huán)系統(tǒng)miR-324-5p可用于診斷心力衰竭，提示其與心血管系統(tǒng)密切相關(guān)。本研究首先通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法初步分析循環(huán)系統(tǒng)miR-324-5p在疾病人群中的表達(dá)分布狀況，結(jié)果表明CHD患者血清miR-324-5p表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高。隨后Kaplan-Meier生存分析表明，miR-324-5p高表達(dá)患者的預(yù)后較低表達(dá)患者差，將承受更多的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及較高的死亡概率。進(jìn)一步采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析CHD的發(fā)病危險(xiǎn)因素，在單因素分析中發(fā)現(xiàn)miR-324-5p表達(dá)水平和BMI都是CHD的發(fā)病危險(xiǎn)因子，HR分別為1.79和2.17；但在多因素分析中，只有BMI是CHD的發(fā)病危險(xiǎn)因子，HR為1.38。說明miR-324-5p在CHD的發(fā)病機(jī)制上并不是一個(gè)主要因素，可能處于一個(gè)旁路通道中，這也同時(shí)說明CHD的發(fā)病是多種因素綜合作用的結(jié)果，miR-324-5p并未起到?jīng)Q定性作用。另一方面，miR-324-5p通過調(diào)控細(xì)胞多種生物學(xué)表現(xiàn)，導(dǎo)致下游基因和細(xì)胞生物學(xué)性狀的一系列變化。作者認(rèn)為在胚胎心臟發(fā)育過程中miR-324-5p通過直接或間接抑制某些基因表達(dá)來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的凋亡和增殖，當(dāng)miR-324-5p的表達(dá)失調(diào)，影響某個(gè)或某些靶基因表達(dá)水平并發(fā)生失控，繼而引起心臟形態(tài)和功能的異常，導(dǎo)致CHD發(fā)生。

綜上所述，在多因素分析中miR-324-5p雖然不是CHD的發(fā)病危險(xiǎn)因子，但是miR-324-5p高表達(dá)的CHD患者卻有較高的死亡概率和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示可以將它作為臨床預(yù)后判斷的輔助指標(biāo)，對(duì)提高CHD患者的生存質(zhì)量有著一定的指導(dǎo)意義。

[1]Sadowski SL．Congenital cardiac disease in the newborn infant:past,present,and future[J]．Crit Care Nurs Clin North Am，2009，21(1)：37-48．

[2]Donofrio MT，Moon-Grady AJ，Hornberger LK，et al．Diagnosis and treatment of fetal cardiac disease:a scientific statement from the American Heart Association[J]．Circulation，2014，129(21)：2183-2242．

[3]Muner-Hernando M，Gil-Mira M，Zapardiel I．Advances in prenatal diagnosis of congenital heart diseases[J]．Ginecol Obstet Mex，2013，81(6)：334-344．

[4]Ding X，Ding J，Ning J，et al．Circulating microRNA-122 as a potential biomarker for liver injury[J]．Mol Med Rep，2012，5(6)：1428-1432．

[5]Luo J，Chen M，Huang H，et al．Circulating microRNA-122a as a diagnostic marker for hepatocellular carcinoma[J].Onco Targets Ther，2013，6(4)：577-583．

[6]Zahm AM，Thayu M，Hand NJ，et al．Circulating microRNA is a biomarker of pediatric Crohn disease[J]．J Pediatr Gastroenterol Nutr，2011，53(1)：26-33．

[7]Zhao Z，Zhao Q，Warrick J，et al．Circulating microRNA miR-323-3p as a biomarker of ectopic pregnancy[J]．Clin Chem，2012，58(5)：896-905．

[8]Alvarez-Garcia I，Miska EA．MicroRNA functions in animal development and human disease[J]．Development，2005，132(21)：4653-4662．

[9]Gomase VS，Parundekar AN．microRNA:human disease and development[J]．Int J Bioinform Res Appl，2009，5(5)：479-500．

[10]Borik S，Simon AJ，Nevo-Caspi Y，et al．Increased RNA editing in children with cyanotic congenital heart disease[J]．Intensive Care Med，2011，37(10)：1664-1671．

[11]Chowdhury S，Erickson SW，MacLeod SL，et al．Maternal genome-wide DNA methylation patterns and congenital heart defects[J]．PLoS One，2011，6(1)：e16506-e16509．

[12]Topkara VK，Mann DL．Role of microRNAs in cardiac remodeling and heart failure[J]．Cardiovasc Drugs Ther，2011，25(2)：171-182．

[13]Ellis KL，Cameron VA，Troughton RW，et al．Circulating microRNAs as candidate markers to distinguish heart failure in breathless patients[J]．Eur J Heart Fail，2013，15(10)：1138-1147．

Plasma miR-324-5p for evaluation of prognostic risk classification in patients with simple congenital heart disease

WANNan，WANGLu，MENGDong-ya，ZHENGWei，HUXiao-fang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang,Liaoning110016,China)

Objective To investigate the change of plasma miR-324-5p expression in the patients with simple congenital heart disease(CHD) and to evaluate its clinical application value in the prognosis and the risk classification of CHD.Methods 76 children patients with CHD and 13 healthy controls were detected the plasma expression levels of miR-324-5p by the real-time PCR.The clinical application value of plasma miR-324-5p in the prognosis and the risk classification of CHD was comprehensively evaluated by adopting the Kalpan-Meier survival analysis,Cox proportional hazard model.Results The peripheral plasma miR-324-5p expression level in the simple CHD group was increased compared with the control group,the difference had statistical significance (P<0.05);the Kalpan-Meier survival analysis indicated that the higher miR-324-5p expression group had much higher recurrent risk and much higher death probability(P<0.05);the Cox proportional hazard model indicated that in the univariate analysis,miR-324-5p and BMI were the risk factors of CHD(P<0.05).The hazard ratio (HR) was 1.79 and 2.17 respectively.The multivariate analysis demonstrated that only BMI was the risk factor of CHD(P<0.05),HR was 1.38,95%CI(1.12，1.79).Conclusion Plasma miR-324-5p as a biomarker of CHD diagnosis could have certain clinical application value,but should be combined application with other indicators.

congenital heart disease; miR-324-5p; prognosis

萬楠，男，碩士，副主任技師，主要從事心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)研究。△

，E-mail：syplay@me.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.010

A

1672-9455(2015)05-0603-03

2014-10-26

2014-12-10)