崔 艷，李 艷，喬 斌，汪 明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430060)

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·論 著·

武漢市乙型肝炎病毒基因型分布和P區(qū)耐藥突變模式及兩者相關(guān)性分析*

崔 艷，李 艷△，喬 斌，汪 明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430060)

目的 探討武漢地區(qū)乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情況和P區(qū)耐藥突變模式及兩者的相關(guān)性。方法 提取HBV-DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增后以直接測(cè)序法檢測(cè)HBV基因型及P區(qū)耐藥突變位點(diǎn)，用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 219例慢性乙型肝炎患者血漿中檢出HBV基因型B型135例(61.6%)、C型61例(27.9%)、D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)、B+F+G混合型1例(0.4%)、未分型17例(7.8%)。對(duì)202例分出基因型的標(biāo)本進(jìn)行耐藥突變檢測(cè)，其中76例發(fā)生耐藥突變，突變位點(diǎn)以M204I(42.9%)、M204V(22.1%)、L180M(27.3%)多見。YMDD突變的發(fā)生率在B、C基因型之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但YMDD突變類型中的M204V和M204I在B、C基因型中的分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 武漢地區(qū)HBV基因型以B型和C型為主，HBV耐藥突變以M204I、M204V、L180M多見，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)基因分型和耐藥突變結(jié)果為慢性乙型肝炎患者選擇適合的治療方案。

乙型肝炎病毒； 基因型； 耐藥突變； 核苷(酸)類似物

乙型肝炎病毒(HBV)基因型包括A～H,不同地區(qū)的分布特征可能存在差異，我國以B、C型常見，還有少量D型?；蛐褪怯绊慔BV感染結(jié)果的主要決定因素之一，不同基因型的致病性有所差異，并且與臨床表現(xiàn)、預(yù)后、治療應(yīng)答均有一定的關(guān)系[1]。目前，臨床應(yīng)用最廣泛的抗HBV藥物為核苷(酸)類似物，但由于長期及不規(guī)范用藥，使HBV產(chǎn)生耐藥突變，影響了治療效果。因此，本研究進(jìn)行HBV基因型分型及耐藥變異檢測(cè)，以期為臨床醫(yī)生合理用藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 219例血漿標(biāo)本均來自本院2011年4月至2014年4月門診及住院部的慢性乙型肝炎患者，年齡18～76歲，其中男183例，女36例。慢性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)于2010年更新的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]。所有患者血漿丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)等檢測(cè)均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA提取 HBV-DNA提取采用上海萊楓生物科技有限公司生產(chǎn)的體液游離DNA微量提取試劑盒，提取過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 HBV基因分型及耐藥突變檢測(cè) 對(duì)待檢血漿標(biāo)本中提取的HBV-DNA進(jìn)行Pol基因RT區(qū)核酸聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增后直接測(cè)序，測(cè)序引物為上海生工合成，上游引物為5′-TGG ACT TCT CTC AAT TTT CT-3′，下游引物為5′-TGA CAG ACT TTC CAA TCA AT-3′，采用美國ABI公司3500測(cè)序儀及其配套試劑檢測(cè)，并將所測(cè)序列與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)核酸序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)中HBV-DNA Pol基因RT區(qū)參考序列AF100309、AB014381和X51970等進(jìn)行比對(duì)分析，確定受檢血漿標(biāo)本中HBV-DNA的基因型，以及所檢測(cè)區(qū)域是否發(fā)生耐藥突變和其耐藥突變類型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、頻次或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBV-DNA基因型分布及耐藥分布 219例慢性乙型肝炎患者血漿中共檢出HBV基因型B型135例(61.6%)、C型61例(27.9%)、D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)及B+F+G混合型1例(0.4%)、未分型17例(7.8%)。B基因型標(biāo)本中50例發(fā)生耐藥突變，C基因型標(biāo)本中26例發(fā)生耐藥突變，B、C基因型耐藥突變發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.609，P=0.057)。HBV耐藥突變檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 HBV耐藥突變檢測(cè)結(jié)果

2.2 HBV耐藥模式分布 對(duì)202例基因分型標(biāo)本中HBV-DNA的P區(qū)進(jìn)行測(cè)序，其中12例沒有發(fā)生突變，113例發(fā)生的突變尚不確定與核苷(酸)類似物耐藥相關(guān)，76例明確發(fā)生耐藥突變。與耐藥相關(guān)的單個(gè)氨基酸突變模式見表1。

表1 HBV單個(gè)氨基酸突變模式結(jié)果

表2 HBV YMDD突變與基因型的關(guān)系

表3 HBV YMDD突變類型與基因型的關(guān)系

2.3 YMDD突變與基因型之間的關(guān)系 B基因型和C基因型YMDD突變的發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.783,P=0.182)；而YMDD突變類型中的M204V和M204I在B、C兩種基因型中的分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.01,P=0.014)。見表2～3。

3 討 論

HBV基因型分布呈現(xiàn)一定的地區(qū)差異性，其中A基因型主要分布在歐洲西部、北部及非洲撒哈拉沙漠地區(qū)；B、C型主要分布在遠(yuǎn)東東部和亞洲南部；D型的分布較廣，常見于地中海地區(qū)及近東地區(qū),同時(shí)在亞洲少數(shù)地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)；E型主要在非洲撒哈拉沙漠地區(qū)；F型主要分布在美國[3]。本研究顯示，武漢市慢性乙型肝炎患者的基因型以B型(61.6%)為主，其次為C型(27.9%)，這一結(jié)果符合我國HBV基因型南方以B型為主、北方以C型為主的分布特征[4-5]。此外，在本次研究中還發(fā)現(xiàn)了在我國較少見的幾種基因型，其中D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)、B+F+G混合型1例(0.4%)，由此可見武漢市HBV基因型分布有復(fù)雜化的趨勢(shì)。臨床上進(jìn)行HBV基因分型檢測(cè)具有相當(dāng)重要的意義，與B基因型相比，C基因型的HBV感染更易發(fā)生重癥肝病、肝硬化、肝癌等肝臟疾病。此外，C基因型HBV感染者的乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性率較高，病毒復(fù)制活躍，免疫清除比較晚，不易發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)化[1]。而且，不同基因型的HBV對(duì)抗病毒治療藥物的反應(yīng)有著十分大的差異，總體上B基因型比C基因型易治療[6]。

目前已明確有抗HBV效果的藥物包括核苷(酸)類似物及α干擾素，其中以核苷(酸)類似物應(yīng)用最為廣泛。但由于核苷(酸)類似物的長期應(yīng)用及不規(guī)范用藥，使HBV產(chǎn)生耐藥突變，影響了治療效果。因此，定期進(jìn)行HBV耐藥變異相關(guān)檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)臨床醫(yī)生用藥具有相當(dāng)重要的意義。我國慢性乙型肝炎抗病毒治療專家委員會(huì)認(rèn)為采用核苷(酸)類似物來進(jìn)行長期治療的關(guān)注點(diǎn)在于選擇性耐藥位點(diǎn)的出現(xiàn)，治療期間至少應(yīng)該每3個(gè)月進(jìn)行一次HBV-DNA耐藥變異檢測(cè)[7]。

本研究中，76例標(biāo)本檢出有核苷(酸)類似物相關(guān)耐藥變異，突變位點(diǎn)以M204I(42.9%)、M204V(22.1%)、L180M(27.3%)多見，其中M204I/V位點(diǎn)的變異與拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋的耐藥相關(guān)。L180M位點(diǎn)的變異常引起拉米夫定、替比夫定、恩曲他濱、恩替卡韋發(fā)生耐藥。A181T/V、N236T、L80I/V、V84M等位點(diǎn)的變異與阿德福偉的耐藥有關(guān)，其中A181T位點(diǎn)突變較為特殊，除了可引起拉米夫定、替比夫定、阿德福韋的非典型耐藥以外，還影響S蛋白的表達(dá)分泌[8]。此外，rtA181位點(diǎn)變異被認(rèn)為是多藥耐藥的標(biāo)志，此位點(diǎn)的變異除了導(dǎo)致阿德福韋耐藥外，還可引起替諾福韋、拉米夫定和替比夫定耐藥[8]，有文獻(xiàn)建議臨床上治療rtA18l位點(diǎn)突變的患者應(yīng)該采用替諾福韋與恩替卡韋聯(lián)合用藥的治療方案[9]。

YMDD變異是HBV對(duì)拉米夫定最常見的耐藥變異模式。耐藥基因位點(diǎn)YMDD位于聚合酶的C區(qū)(rtM204I或rtM204V)，分別是YMDD中的蛋氨酸(M)被異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)所取代，形成YIDD或YVDD變異，這兩種變異分別是HBV基因組第739位堿基腺嘌呤(A)被鳥嘌呤(G)替代和第741位堿基鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)替代[10-11]。本研究分析了拉米夫定經(jīng)典耐藥中的YMDD突變與基因型的關(guān)系，以及YMDD突變類型與基因型的關(guān)系。分析顯示，YMDD的發(fā)生在B、C基因型之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而YMDD中的M204I、M204V在B、C基因型中的分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。YMDD突變比例隨著服藥時(shí)間的延長而增加，服用拉米夫定第1、2、3、4年的耐藥發(fā)生率分別為14%、38%、49%和66%[12]。也有文獻(xiàn)表明YMDD突變的發(fā)生率可能與HBeAg和HBV-DNA水平具有相關(guān)性[13-14]。

綜上所述，臨床醫(yī)生在治療慢性乙型肝炎時(shí)應(yīng)結(jié)合HBV基因分型和耐藥突變模式及其他檢測(cè)結(jié)果制訂出合理的治療方案，從而達(dá)到理想的治療效果。

[1]李艷，李金明．個(gè)體化醫(yī)療中的臨床分子診斷[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：197-198．

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J]．中華肝臟病雜志，2011，19(1)：13-24．

[3]Sunbul M．Hepatitis B virus genotypes:global distribution and clinical importance[J]．World J Gastroenterol，2014，20(18)：5427-5434．

[4]劉純，劉偉，王凱，等．天津地區(qū)慢性乙型肝炎患者病毒基因型的分析及臨床意義[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24(10)：174-179．

[5]劉會(huì)彩，陳國華．乙型肝炎病毒基因分型與臨床的相關(guān)性探討[J]．中國實(shí)用醫(yī)藥，2014，9(12)：90-91．

[6]明月，謝奇峰，楊林．B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡的比較研究[J]．中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2013，27(5)：344-347．

[7]慢性乙型肝炎抗病毒治療專家委員會(huì)．慢性乙型肝炎抗病毒治療專家共識(shí)：電子版[J]．中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志，2010，4(1)：49-53．

[8]Warner N，Locarnini S．The antiviral drug selected hepatitis B virus rtA18lT/sWl72＊mutant has a dominant negative secretion defect and alters the typical profile of viral rebound[J]．Hepatology，2008，48(1)：88-98．

[9]Zoulim F，Locarnini S．Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ide analogues[J]．Gastroenterology，2009，137(5)：1593-1608．

[10]Yang J，Zhang H，Chen X，et al．Relationship between hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus genotype with spontaneous YMDD mutations[J]．World J Gastroenterol，2013，12(24)：398-404．

[11]Ozekinci T，Mese S，Ozbek E，et al．Lamivudine and adefovir motif variants detected in chronic hepatitis B patients[J]．Clin Ter，2014，165(1)：13-17．

[12]Wu F，Wu MJ，Zhuge XL，et al．Correlation of the occurrence of YMDD mutations with HBV genotypes,HBV-DNA levels,and HBeAg status in Chinese patients with chronic hepatitis B during lamivudine treatment[J]．Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2012，11(2)：172-176．

[13]張?bào)?，高武，劉小榮．慢性乙型肝炎患者YMDD突變與HBV DNA定量水平相關(guān)性研究[J]．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(22)：2724-2726．

[14]Tan YW，Ge GH，Zhao W，et al．YMDD motif mutations in chronic hepatitis B antiviral treatment naive patients:a multi-center study[J]．Braz J Infect Dis，2012，16(3)：250-255．

Distribution of genotypes of hepatitis B virus in Wuhan and P region drug resistance mutation patterns and their correlation analysis*

CUIYan,LIYan△,QIAOBin,WANGMing

(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To study the distribution of hepatitis B virus(HBV) genotypes and its correlation with the mutation patterns in the P region of HBV.Methods HBV DNA was extracted for conducting PCR.Then the HBV genotypes and P region drug resistance mutation sites were detected by using the direct sequencing method and the detection results were statistically analyzed by using the SPSS 19.0 software.Results Among 219 patients with chronic hepatitis B,135 cases(61.6%) of HBV genotype B,61 cases(27.9%) of genotype C,2 cases (0.9%) of genotype D,3 cases (1.4%) of genotype B+C,1 case(0.4%) of genotype B+F+G and 17 cases (7.8%) of undefined genotype were detected out.Among them,76 cases developed the drug resistance mutation,the mutation sites were mainly M204I(42.9%),M204V(22.1%) and L180M(27.3%).The occurrence rate of YMDD mutation had no statistically significant difference between the gynotype B and C (P>0.05).But in the YMDD mutation patterns,M204I and M204V had statistical difference in the distribution of C and D genotypes(P<0.05).Conclusion The HBV genotypes in Wuhan are mainly genotype B and C.The major drug resistant mutations are M204I,M204V and L180M.Clinical doctors should select the proper therapeutical scheme for treating chronic hepatitis B based on the results of the genotyping and drug-resistant mutations.

hepatitis B virus； genotype; drug-resistant mutation； nucleos(t)ide analogues

國家重點(diǎn)臨床?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目(財(cái)社【2010】305號(hào))。

崔艷，女，在讀研究生，主要從事分子診斷研究。△

，E-mail：yanli.1120@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.001

A

1672-9455(2015)05-0577-03

2014-11-05

2014-12-16)