賴 力，韓莉莉，沈曉麗

(福建省立醫(yī)院司法鑒定所/福建省心血管病重點實驗室/福建醫(yī)科大學省立臨床學院,福州 350001)

?

·論 著·

短串聯(lián)重復序列基因座在石蠟包埋組織中的應用

賴 力，韓莉莉，沈曉麗△

(福建省立醫(yī)院司法鑒定所/福建省心血管病重點實驗室/福建醫(yī)科大學省立臨床學院,福州 350001)

目的 探討3種STR基因座分型系統(tǒng)在石蠟包埋組織基因座分型的差異。方法 采用Qiagen 法對保存1個月的石蠟包埋組織進行DNA提取，用Identifiler系統(tǒng)、PowerPlex 21系統(tǒng)及Investigator HDplex系統(tǒng)對STR基因座進行聚合酶鏈反應復合擴增、毛細管電泳、熒光檢測及片段分析，比較3種系統(tǒng)的STR基因座檢出率，并且采集組織同一個體的血液、毛發(fā)、口腔拭子等樣本進行STR基因座分型，比較同一個體不同器官組織STR基因座分型的差異。結果 經紫外分光光度計測定石蠟包埋組織的DNA濃度為6～85 ng/μL，純度1.7～2.2，Identifiler系統(tǒng)能夠在DNA濃度大于15 ng/μL時得到完整的基因座分型，PowerPlex 21系統(tǒng)在DNA濃度為85 ng/μL時得到完整的基因座分型，而HDplex系統(tǒng)在石蠟組織檢測中均未獲得完整的基因座分型。石蠟包埋組織與其他器官組織分型結果存在差異，其中D6S474、D4S2366和D21S2055基因座存在等位基因不平衡或基因座丟失現象。結論 石蠟包埋組織中DNA的濃度和純度是STR基因座分型的重要影響因素，遺傳信息丟失現象與檢驗對象的性狀有關，也與所采用的檢測系統(tǒng)有關，Identifiler系統(tǒng)對石蠟包埋組織的STR基因座分型具有較高的實用價值。

石蠟包埋組織； STR分型； 個體識別

石蠟包埋組織(FFPET)是病理學、法醫(yī)病理學進行疾病診斷和科學研究的常用檢驗材料，是醫(yī)院病理科和法醫(yī)鑒定機構的常規(guī)檔案保存材料，能夠滿足長期保存的要求。在某些特殊情況下，FFPET能夠作為涉嫌保險欺詐、調錯病理標本的醫(yī)療糾紛及親權司法鑒定和個體識別等案件的重要檢驗材料。但由于在對組織進行石蠟包埋過程中，常規(guī)使用甲醛對組織進行固定，而甲醛會對組織中DNA造成化學損傷，使DNA降解比較嚴重。有研究報道，組織用10%甲醛固定時間超過1周，蛋白和DNA的交聯(lián)作用就會使核酸破壞，嘌呤基的β糖苷鍵發(fā)生水解使DNA斷裂破壞[1-2]。目前國內外不少學者致力于研究從FFPET中取得高質量DNA的方法，但并不能給FFPET基因分型帶來本質性改觀。本研究系統(tǒng)分析FFPET的常見STR基因座分型檢出情況，旨在探討常見STR基因座分型系統(tǒng)用于FFPET分型的應對策略，并且比較FFPET與同一個體其他組織器官樣本的基因座分型情況，探討其在個體識別中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 系統(tǒng)與儀器 QIAamp?RDNA FFPE Tissue 系統(tǒng)盒(德國Qiagen公司產品)、AmpFISTR Identifiler系統(tǒng)盒(美國AB公司產品)、PowerPlex 21系統(tǒng)盒(美國Promega公司產品)、Investigator HDplex系統(tǒng)盒(德國Qiagen公司產品)、微量紫外分光光度計 ND-1000(美國NanoDrop公司產品)、AB 9700型聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀及AB 3130基因分析儀(美國AB公司產品)。

1.2 樣品 某醫(yī)院送檢FFPET切片6份，組織來源于某患者的腸道腫瘤組織。活檢組織樣本用10%甲醛固定，24 h內按標準程序取樣，制備成FFPET，于室溫下保存1個月，制作4～5 μm的FFPET切片。另外取該患者的血樣5 μL、帶毛囊的毛發(fā)1根及口腔拭子1份作為對照。

1.3 樣品預處理 將6份FFPET切片標記為組織1、2、3、4、5、6，分別裝入6個離心管中，各加入1 mL二甲苯，混勻后劇烈振蕩10 s。全速離心2 min棄上清液，再加入1 mL無水乙醇振蕩混勻，全速離心2 min后棄上清液，沉淀放置室溫中揮發(fā)殘存乙醇。

1.4 DNA提取 FFPET使用Qiagen法提取DNA，操作嚴格按照使用手冊進行。組織身源者的血樣、毛發(fā)及口腔拭子的DNA提取采用Chelex 法，操作步驟參照親權鑒定技術規(guī)范(SF/Z JD0105001-2010)執(zhí)行。所獲得的DNA樣品經過微量紫外分光光度計ND-1000進行定量及純度分析,對濃度最高FFPET的DNA進行半定量稀釋并檢測稀釋后的濃度。

1.5 STR基因座檢測 6份FFPET的DNA樣品及血樣、毛發(fā)、口腔拭子DNA樣品均取1 μL DNA作為模板，分別采用AmpFISTR Identifiler系統(tǒng)盒、PowerPlex 21系統(tǒng)盒及Investigator HDplex系統(tǒng)盒等3種分型系統(tǒng)進行STR基因座的復合擴增，參照系統(tǒng)說明書配制PCR反應體系。3種系統(tǒng)的擴增產物通過3130基因分析儀進行毛細管電泳，Data collection軟件收集熒光信號及GeneMapper ID V3.2軟件對STR基因座進行分型，分別以LIZ 500、ILS500及BTO550內標作為對照，以各色熒光峰值振幅閾值大于50為篩選標準，確定檢出的基因座峰型。檢測3種系統(tǒng)總共30個常見的STR基因座，觀察基因座檢出情況，并且比較FFPET與其身源其他組織在基因座分型上的差異。

2 結 果

2.1 DNA定量結果 見表1。FFPET的DNA樣品(組織1～6)及血樣、毛發(fā)、口腔拭子的DNA樣品均獲得超過1 ng/μL的濃度。石蠟組織DNA樣品的純度A260/A280位于1.7～2.2。血樣、毛發(fā)、口腔拭子DNA樣品的純度為1.2～1.5。

表1 檢測樣品DNA定量結果

注：/表示未檢測。

2.2 常見STR基因座分型系統(tǒng)的分型結果 Identifiler系統(tǒng)包括15個STR基因座，PowerPlex 21系統(tǒng)包括20個STR基因座，HDplex系統(tǒng)包括12個STR基因座，3種系統(tǒng)均具有1個性別基因座Amelogenin。當基因座的基因型為純合子基因型時，分型圖譜上顯示1條峰，如果為雜合子基因型則顯示2條峰。組織1、2、3用Identifiler系統(tǒng)檢測，16個基因座均能全部檢出，基因座檢出率為100%，而組織4～6的基因座檢出率為50%～81%；當使用PowerPlex 21系統(tǒng)分型，僅組織2能夠檢出全部基因座，組織3～6的基因座檢出率為52%～90%；在使用HDplex系統(tǒng)分型時，6個組織均未獲得完整的基因座分型結果，基因座檢出率為46%～92%。6份FFPET的DNA樣品在3種系統(tǒng)的基因座分型上均能得到全部完整的峰型，且分型結果一致(表2)。組織2的基因座分型結果與正常組織分型結果最為接近，在檢測的常見30個STR基因座中有27個基因座的分型結果與其他器官組織一致，僅存在D6S474、D4S2366基因座部分等位基因丟失和D21S2055基因座全部丟失(表3)。在檢出全部基因座的分型圖譜上，各STR基因座分型峰高并不均勻，大片段基因座峰高偏矮，小片段基因座峰高不均一。在未能檢出全部基因座的分型圖譜上，本文發(fā)現均存在大片段STR基因座等位基因的丟失，而且隨著DNA濃度降低，丟失的基因座數目逐漸增加，小于200 bp長度的小片段基因座能夠獲得較好的分型結果，而250 bp以上的大片段基因座分型存在異常，出現等位基因不平衡擴增及基因座丟失乃至無結果等現象。

表2 6份FFPET的DNA樣品在3種系統(tǒng)的基因座檢出結果[n(%)]

表3 30個STR基因座在組織2與血樣、毛發(fā)、口腔拭子的基因座分型結果

續(xù)表3 30個STR基因座在組織2與血樣、毛發(fā)、口腔拭子的基因座分型結果

注：下劃線部分為存在異常分型的基因座，只檢出部分基因型，其余為純合子基因型，2條染色體等位基因相同；-表示無數據。

3 討 論

根據人群DNA片段中的STR基因座具有高度多態(tài)性且同一個體各組織器官具有同源性等特點，可以利用STR基因座對個體和生物學檢驗材料進行同一認定。由于單個STR基因座的遺傳信息有限，所以目前個體識別和親權鑒定領域的主要檢測手段是多個STR基因座組成的檢測系統(tǒng)，其檢驗策略是收集盡可能多的STR基因座遺傳信息以提高檢測系統(tǒng)的個體識別能力。

本研究選擇的檢測系統(tǒng)有3種，分別是包括16個基因座的Identifiler系統(tǒng)、21個基因座的PowerPlex 21系統(tǒng)及13個基因座的HDplex系統(tǒng)。Identifiler系統(tǒng)是目前國內外通行的STR基因座分型系統(tǒng)，其應用價值已經得到廣泛驗證[3-4]。PowerPlex 21系統(tǒng)是目前新研制且STR基因座設計比較全面的系統(tǒng)之一，增加了Identifiler系統(tǒng)不具備的且被證實具有高度多態(tài)性的基因座D12S391、D6S1043、Penta D及Penta E。HDplex系統(tǒng)是新研制的STR基因座分型系統(tǒng)，融合了多個非CODIS系統(tǒng)的基因座，已被證實適合于群體遺傳學研究[5]。PowerPlex 21系統(tǒng)和HDplex系統(tǒng)所研究樣本多為常規(guī)血樣檢驗材料，未見特殊檢驗材料方面的應用。在基因座片段大小的分布上，Identifiler系統(tǒng)所有基因座均在400 bp之內，而PowerPlex 21系統(tǒng)由于檢測的基因座數目較多，其片段大小均在500 bp之內，HDplex系統(tǒng)雖然基因座數目不多，但是基因座多態(tài)性高，等位基因型豐富，故基因座片段大小也在500 bp之內。

FFPET是醫(yī)院病理科記錄患者病情及患者信息溯源的重要個人檔案，在醫(yī)療糾紛、保險理賠等方面能夠成為提供個人信息的重要生物檢驗材料[6]。組織在石蠟包埋處理前都必須經過10%甲醛固定，甲醛固定時間長短直接影響STR基因座的檢驗[7]。目前醫(yī)院病理科由于臨床需要，一般在甲醛固定24 h內對組織進行石蠟包埋等處理，最多不超過48 h，短時間的甲醛固定可以最大限度減少甲醛對DNA的降解和破壞。

由于甲醛對DNA的破壞，DNA分子隨機降解成小片段，使STR基因座無法檢出，從而導致遺傳信息的缺失[8]。遺傳信息的缺失與檢驗材料本身有關，也與檢驗者所采用的分析策略有關。本研究以保存相同時間的FFPET為檢驗對象，保證了組織甲醛固定時間及石蠟組織保存時間的一致性。DNA提取的方法都選擇Qiagen法，Qiagen法使用商業(yè)化抽提系統(tǒng)盒，獲得的DNA純度高，無PCR抑制劑，這樣保證了每份組織抽提獲得的DNA降解程度一致，只是在對切片組織的數量上加以區(qū)別及抽提DNA的濃度上進行差異化處理。研究中發(fā)現，Identifiler系統(tǒng)相對PowerPlex 21系統(tǒng)、HDplex系統(tǒng)，能夠在DNA濃度較低時獲得全部完整的基因座分型，其對降解檢驗材料的DNA適應程度要優(yōu)于PowerPlex 21系統(tǒng)和HDplex系統(tǒng)。在基因座出現丟失現象的分型圖譜中，片段大小在200 bp以內的基因座分型結果正常，在200～300 bp范圍內的基因座分型出現程度不等的等位基因擴增不平衡及等位基因丟失現象，而大于300 bp的基因座分型基本上都存在丟失。Identifiler系統(tǒng)大部分基因座都位于300 bp以內，基因座的檢出率是3個系統(tǒng)中最高的，由此可見對固定時間短，DNA降解程度不大的FFPET進行STR基因座分型，Identifiler系統(tǒng)相對其他常用系統(tǒng)能夠獲得較好的分型結果。林旭等[9]運用Identifiler系統(tǒng)對硅珠法提取FFPET的DNA質量評估，在46例(93%)得出完整16個基因座峰型，既驗證了硅珠法提取組織DNA的優(yōu)勢，也驗證了Identifler系統(tǒng)適合于FFPET的基因座分型。張越等[10]將多重置換擴增技術(MDA)應用于病理切片的DNA分型，認為MDA可提高病理切片模板基因組量，相對降低PCR 擴增抑制物濃度，減少等位基因脫扣現象，有效提高了基因座檢出率。

本研究發(fā)現，FFPET與其身源者其他器官組織STR基因座分型結果存在一定差異，FFPET中D6S474基因座檢出基因型13、D4S2366基因座檢出基因型11、D21S2055基因座未檢出基因型，而其身源者的血液、毛發(fā)及口腔拭子中脫落細胞的STR基因座分型均檢出D6S474基因型13/14、D4S2366基因型9/11、D21S2055基因型25/35。導致上述組織中STR基因座存在差異的原因可能是由于腫瘤組織中STR基因座的變異，包括了完全雜合性丟失和部分雜合性丟失等，也可能是由于本身組織DNA降解破壞后大片段基因座的擴增受到影響[11]。鑒于在已檢出的常見STR基因座中，FFPET與其他器官組織的分型結果一致，且異?；蜃鶠榇笃位蜃?，故考慮基因座的差異系組織DNA降解造成的可能性較大。

在日常鑒定檢測工作中，時常需要對特殊檢驗材料進行STR基因座分型，除了要慎重選擇標本處理方法外，所采用的檢測系統(tǒng)也是至關重要的因素。MiniFiler系統(tǒng)由一系列小片段STR基因座組成，適合于微量降解檢驗材料，但是在一般實驗室未能普及應用，所以使用常見STR基因座分型系統(tǒng)還是實驗室的常用方法。本研究發(fā)現，Identifiler系統(tǒng)穩(wěn)定性更高，更適合于微量降解檢驗材料。

[1]Lehmann U,Kreipe H.Real-time PCR analysis of DNA and RNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded biopsies[J].Methods,2001,25(4):409-418.

[2]Zsikla V,Baumann M,Cathomas G.Effect of buffered formalin on amplification of DNA from paraffin wax embedded small biopsies using real-time PCR[J].J Clin Pathol,2004,57(6):654-656.

[3]吳微微，郝宏蕾，林錦鋒，等．3種國產化試劑盒與IdentifilerTM試劑盒檢驗結果比較[J]．中國法醫(yī)學雜志，2011，26(1)：45-47．

[4]闕庭志，嚴品華，林源，等．IdentifilerTM系統(tǒng)在親子鑒定中的應用評估[J]．法醫(yī)學雜志，2009，25(3)：184-186．

[5]張素華，張喆人，孫寬，等．Investigator HDplex試劑盒在華東漢族人群中的法醫(yī)學應用價值[J]．法醫(yī)學雜志，2012，28(5)：351-354．

[6]柳燕，李莉，趙珍敏，等．甲醛固定石蠟包埋組織STR分型檢測[J]．法醫(yī)學雜志，2009，25(5)：337-340．

[7]袁麗，魯滌，毋麗娜．石蠟包埋人體組織STR檢驗的探討[J]．法律與醫(yī)學雜志，2006，13(1)：50-52．

[8]黨華偉，毛炯，王惠，等．疑難生物檢材法醫(yī)DNA檢驗的現狀與進展[J]．法醫(yī)學雜志，2012，28(1)：52-54．

[9]林旭，王建文，尹雅莎，等．運用Identifiler試劑盒對硅珠法提取石蠟包埋組織DNA質量的評估[J]．南京醫(yī)科大學學報:自然科學版，2012，32(4)：577-581．

[10]張越，陳陽，楊元立，等．多重置換擴增在病理切片DNA分型中的應用[J]．法醫(yī)學雜志，2013，29(1)：17-20．

[11]方建新，李成濤，肖立．13個STR位點在人消化系統(tǒng)腫瘤組織中的變異分析[J]．法醫(yī)學雜志，2007，23(4)：280-282．

Application of short tandem repeats loci genotyping in paraffin embedded tissueLAI

Li，HANLi-li，SHENXiao-li△

(ForensicSciencesInstituteofFujianProvincialHospital/FujianProvincialKeyLaboratoryofCardiovascularDisease/ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou,Fujian350001,China)

Objective To study the difference of the short tandem repeats(STR) loci genotyping in paraffin embedded tissue by using three kits.Methods DNA were extracted from intestinal tumor in paraffin-embedded tissue which was preservd for a month by using Qiagen method,fluorescent multiplex PCR by using identifiler kit,PowerPlex 21 kit and Investigator HDplex kit,capillary electrophoresis and fragment analysis technique were used to detect STR loci.Comparing the recalling rations of STR loci of three kits and the genotype of the homologous normal samples which include paraffin embedded tissue,blood,hair and oral swab.Results DNA concentration extracted from paraffin-embedded tissue were detected between 6-85 ng/μL,OD=1.7-2.2.when DNA concentration >15 ng/μL,the full STR loci genotype was detected by identifiler kit,and when DNA concentration was 85 ng/μL,the full STR loci genotype was detected by PowerPlex 21 kit,however,there was no full peaks of all the STR loci by using HDplex kit.There were several different STR loci genotype between paraffin embedded tissue and other homologous normal samples.There were allelic imbalance and drop-outs in D6S474,D4S2366 and D21S2055.Conclusion The concentration and purity of DNA extracted from paraffin embedded tissue were the important influential factors for STR loci genotype.The phenomenon of missing genetic information was related to sample properties and the detecting system.There was high practical value for STR loci genotyping in paraffin embedded tissue by using identifiler kit.

paraffin embedded tissue; STR typing; individual identification

賴力,男,碩士，主管技師，主要從事法醫(yī)物證、醫(yī)學遺傳學及心臟標志物檢測方面的研究。

△通訊作者,E-mail:sxli3318@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.026

A

1672-9455(2015)03-0352-03

2014-08-28

2014-10-26)