劉悅越，高加梅，范行良，杜加亮，劉 艷，國(guó) 泰

△(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

?

·論 著·

血漿中丙型肝炎病毒核酸在不同保存條件下的穩(wěn)定性*

劉悅越，高加梅#，范行良，杜加亮，劉 艷，國(guó) 泰

△(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的 探討不同保存條件和時(shí)間對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)RNA穩(wěn)定性的影響。方法 將22份血漿樣本置于-20 ℃保存4周，4 ℃保存12 d，室溫(20～25 ℃)保存7 d，反復(fù)凍融5次，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定HCV RNA水平，考察HCV RNA穩(wěn)定性。結(jié)果 樣本在-20 ℃保存4周HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.14 lg，±95%CI≤0.20 lg；4 ℃保存12 d HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.39 lg，4 ℃保存12 d時(shí)95%CI下限為-0.50 lg，<12 d時(shí)±95%CI≤0.24 lg；室溫保存7 d HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.40 lg，室溫保存7 d處理組95%CI下限為-0.53 lg，<7 d時(shí)±95%CI≤0.29 lg；反復(fù)凍融5次HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.10 lg，±95%CI≤0.15 lg。結(jié)論 血漿樣本在-20 ℃保存4周、4 ℃保存9 d、室溫保存5 d和反復(fù)凍融5次時(shí)，對(duì)HCV RNA水平影響不明顯，但4 ℃保存12 d或室溫保存7 d后，RNA水平顯著降低，所以應(yīng)避免在這種條件和時(shí)間下保存和運(yùn)輸血漿。

丙型肝炎； 核酸； 穩(wěn)定性

對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)進(jìn)行核酸篩查能夠顯著縮短HCV篩查的窗口期[1]，同時(shí)，定量測(cè)定HCV RNA是臨床診斷、臨床抗病毒藥物療效評(píng)估和預(yù)后的重要指標(biāo)[2]。但由于RNA不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響，因此樣本保存和處理不當(dāng)會(huì)直接影響HCV篩查或核酸定量的檢出率和準(zhǔn)確性。另一方面，HCV核酸標(biāo)準(zhǔn)品的存放條件也對(duì)其質(zhì)量有影響，會(huì)進(jìn)一步影響對(duì)診斷試劑的評(píng)價(jià)和試驗(yàn)結(jié)果的判斷。一些研究者曾報(bào)道不同的樣本采集處理，如血清、血漿、不同抗凝劑下的抗凝全血在不同保存溫度下會(huì)影響HCV RNA的穩(wěn)定性[3-4]，但其著重點(diǎn)在于樣本的采集處理對(duì)HCV RNA穩(wěn)定性的影響。在保存溫度方面考察的時(shí)間較短，且針對(duì)HCV RNA水平較高，約為106copy/mL的強(qiáng)陽(yáng)性樣本，由于HCV核酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)存放條件為-70 ℃及以下，因此本研究以樣本置于-70 ℃作為對(duì)照，采用涵蓋HCV RNA水平高、中、低的血漿樣本，全面考慮樣本可能存放的溫度環(huán)境和時(shí)間，系統(tǒng)考察不同保存溫度在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)和反復(fù)凍融對(duì)HCV RNA穩(wěn)定性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 22份血漿樣本均來(lái)自獻(xiàn)血員，經(jīng)檢測(cè)HCV RNA為陽(yáng)性。

1.2 儀器與試劑 ABI7500熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀。HCV核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?[凱杰生物工程(深圳)有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理 將22份HCV RNA陽(yáng)性血漿樣本分別分裝于1.5 mL無(wú)菌離心管中，每管1 mL，采用不同溫度保存處理，設(shè)為處理組。將分裝好的樣本分別放置于以下條件：-20 ℃保存1、2、3、4周；4 ℃保存3、6、9、12 d；室溫(20～25 ℃)保存1、3、5、7 d；凍融處理：反復(fù)凍融1、3、5次。處理完成后，放入-70 ℃凍存，等待統(tǒng)一檢測(cè)，并以分裝后即刻放入-70 ℃凍存的樣本作為對(duì)照組。

1.3.2 HCV RNA水平測(cè)定 采用凱杰生物工程(深圳)有限公司的HCV核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?進(jìn)行核酸提取和PCR擴(kuò)增檢測(cè)。核酸提?。喊凑赵噭┖姓f(shuō)明提取核酸。同時(shí)設(shè)HCV陰性對(duì)照品、HCV臨界陽(yáng)性對(duì)照品、HCV強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照品。向1.5 mL的滅菌離心管中分別加入25 μL蛋白酶溶液。并加入待測(cè)樣本200 μL和新鮮配制的裂解液，蓋上蓋子，振蕩15 s，充分混勻，于56 ℃溫浴15 min。加入250 μL無(wú)水乙醇，蓋上蓋子，徹底混勻(振蕩15 s)。15～25 ℃下靜置5 min，轉(zhuǎn)入加套管的核酸純化柱，6 000 g離心1 min。倒掉套管中的廢液，將提取柱重新放入套管中。向核酸純化柱中加入500 μL洗液1，6 000 g離心1 min，倒掉套管中的廢液，將提取柱重新放入套管中。加入500 μL洗液2，6 000 g離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將提取柱重新放入收集管中。加入500 μL無(wú)水乙醇，6 000 g離心1 min，丟棄套管，將提取柱放入新的收集管中，20 000 g高速離心3 min，徹底去除乙醇。丟棄收集管，將核酸純化柱放入干凈的1.5 mL離心管中，打開(kāi)提取柱的蓋子，56 ℃溫浴3 min，以徹底去除殘留的液體。將核酸純化柱放入另一干凈的1.5 mL離心管中，加入60 μL 洗脫液，蓋上蓋子，20～25 ℃靜置5 min。20 000 g高速離心1 min，收集濾出液，做好標(biāo)記，4 ℃保存?zhèn)溆?。提取的病毒核酸?yīng)在2 h內(nèi)用于PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增檢測(cè)：按照試劑盒說(shuō)明配置反應(yīng)液，每個(gè)反應(yīng)體系含有HCV RT-PCR反應(yīng)液28 μL，酶混合物2 μL。取待測(cè)樣品的核酸提取物20 μL，反應(yīng)總體積50 μL。擴(kuò)增和檢測(cè)參數(shù)為50 ℃，30 min；95 ℃，15 min；95 ℃，15 s，50 ℃，45 s，72 ℃，15 s，熒光信號(hào)收集設(shè)在50 ℃，45個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系50 μL。擴(kuò)增檢測(cè)的結(jié)果根據(jù)設(shè)置的HCV定量標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)濃度由儀器軟件自動(dòng)分析給出結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將樣本各處理組各時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，并計(jì)算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)算處理組與對(duì)照組的差值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差值的95%置信區(qū)間(CI)。采用SPSS 19.0軟件對(duì)各組處理的結(jié)果進(jìn)行Friedman檢驗(yàn)，比較同一溫度下所有處理組與對(duì)照組結(jié)果差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再進(jìn)行各處理組與對(duì)照組結(jié)果比較，統(tǒng)計(jì)兩組差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分子試驗(yàn)的試驗(yàn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差為0.50 lg，因此如果差值或95%CI在±0.50 lg以下，即不認(rèn)為核酸水平顯著降低[5-7]。

2 結(jié) 果

2.1 樣本中HCV RNA水平 本研究中22份樣本HCV RNA水平及其對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值見(jiàn)表1。對(duì)分裝后即刻放入-70 ℃凍存的對(duì)照組樣本進(jìn)行檢測(cè)，其HCV RNA水平在7.76×102～2.60×106U/mL，覆蓋高、中、低濃度，均值為1.95×105U/mL。

2.2 -20 ℃保存對(duì)血漿HCV RNA穩(wěn)定性的影響 處理組與對(duì)照組差值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差值的95%CI見(jiàn)表2。各處理組HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.14 lg，±95%CI≤0.20 lg。-20 ℃保存1周和2周的結(jié)果與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，-20 ℃保存3周和4周的結(jié)果與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但-20 ℃保存3周和4周之間結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 22份樣本HCV RNA水平

表2 -20 ℃保存不同時(shí)間的血漿HCV RNA穩(wěn)定性(n=22)

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.3 4 ℃保存對(duì)血漿HCV RNA穩(wěn)定性的影響 處理組與對(duì)照組差值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差值的95%CI見(jiàn)表3。各處理組HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.39 lg，4 ℃保存12 d處理組的95%CI下限為-0.50 lg，其他處理組±95%CI≤0.24 lg。4 ℃保存3、6、9、12 d的結(jié)果與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但4 ℃保存3、6、9 d之間結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 室溫保存對(duì)血漿HCV RNA穩(wěn)定性的影響 處理組與對(duì)照組差值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差值的95%CI見(jiàn)表4。各處理組HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.40 lg，室溫保存7 d處理組的95%CI下限為-0.53 lg，其他處理組±95%CI≤0.29 lg。室溫保存1 d的結(jié)果與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，保存3、5、7 d的結(jié)果與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 4 ℃保存不同時(shí)間血漿HCV RNA穩(wěn)定性(n=22)

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

表4 室溫保存不同時(shí)間血漿HCV RNA穩(wěn)定性(n=22)

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.5 反復(fù)凍融對(duì)血漿HCV RNA穩(wěn)定性的影響 處理組與對(duì)照組差值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差值的95%CI見(jiàn)表5。各處理組HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.10 lg，處理組±95%CI≤0.15 lg。反復(fù)凍融3次的結(jié)果與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但反復(fù)凍融1次和5次的結(jié)果與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，反復(fù)凍融1次和5次的結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 反復(fù)凍融的血漿HCV RNA穩(wěn)定性(n=22)

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

3 討 論

HCV核酸檢測(cè)在血液篩查預(yù)防經(jīng)輸血傳播丙型肝炎、臨床診斷、評(píng)價(jià)抗病毒治療效果和預(yù)后中至關(guān)重要[8]，待測(cè)樣本在保存和運(yùn)輸中RNA裂解直接影響病毒的檢出，從而增加檢測(cè)結(jié)果為假陰性的可能性。因此待測(cè)樣本必須在適當(dāng)條件下進(jìn)行保存和運(yùn)輸，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義僅僅是統(tǒng)計(jì)結(jié)論，不一定在現(xiàn)實(shí)中有意義，使用方法和樣本量、樣本中RNA水平分布的不同會(huì)影響結(jié)果，因此并不具有決定性作用。判斷HCV RNA水平是否顯著降低還需要結(jié)合專業(yè)知識(shí)，目前尚無(wú)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)文獻(xiàn)一般認(rèn)為分子試驗(yàn)的試驗(yàn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差為0.50 lg。因此如果差值或95%CI在±0.50 lg以下，即不認(rèn)為核酸水平顯著降低[5-7]。

曾有一些學(xué)者針對(duì)HCV血樣的保存進(jìn)行研究。Baleriola等[5]報(bào)道樣本在-20 ℃凍存1.2年后，HCV RNA水平與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但降低不超過(guò)0.50 lg，認(rèn)為這種RNA損失在試驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，對(duì)臨床判斷的影響不大[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣本在-20 ℃保存1周和2周的結(jié)果與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，-20 ℃保存3周和4周的結(jié)果與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。樣本在-20 ℃凍存1周后，與對(duì)照組相比，HCV RNA水平增加0.03 lg，這種水平升高可能是由于試驗(yàn)誤差引起的；凍存2～4周后，HCV RNA水平平均有所下降，但均不超過(guò)0.14 lg，±95%CI也小于0.20 lg。

Gessoni等[7]指出，在4 ℃保存7 d的全血樣本HCV RNA水平未見(jiàn)顯著降低。Sener等[8]的研究表明，非抗凝樣本在4 ℃保存5周，其HCV RNA水平仍然穩(wěn)定。本研究中4 ℃保存3～12 d的結(jié)果與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但各處理組HCV RNA平均下降幅度不超過(guò)0.39 lg，值得注意的是4 ℃保存12 d后處理組的95%CI下限為-0.50 lg，達(dá)到了人們普遍接受的分子試驗(yàn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差，其他處理組±95%CI不超過(guò)0.24 lg。因此，樣本在4 ℃保存12 d可能會(huì)影響RNA水平的檢測(cè)。

Grant等[9]研究表明，血漿樣本在25 ℃放置5 d，HCV RNA水平(0.20 lg)顯著降低。Comert等[6]的研究表明，室溫下放置1、2、3 d與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但處理組與對(duì)照組的HCV RNA差值平均值不超過(guò)0.20 lg。而本研究室溫保存1 d的結(jié)果與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，保存3、6、9 d的結(jié)果與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各處理組HCV RNA平均下降幅度不超過(guò)0.40 lg，但室溫保存7 d處理組的95%CI下限為-0.53 lg，分子試驗(yàn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差其他處理組±95%CI均小于0.29 lg，說(shuō)明樣本在室溫保存7 d可能會(huì)使HCV RNA水平明顯降低。

RNA保存最常用的方法是凍存,已有一些學(xué)者針對(duì)凍存對(duì)HCV RNA的影響進(jìn)行了研究[10-11]。近期Baleriola等[5]報(bào)道，樣本在-70 ℃凍存9年后，HCV RNA水平與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但降低不超過(guò)0.50 lg，認(rèn)為這種RNA損失在試驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，對(duì)臨床判斷的影響不大。但是反復(fù)凍融會(huì)影響HCV RNA的穩(wěn)定性。Gessoni等[7]指出，反復(fù)凍融5次后HCV RNA水平顯著降低。但Comert等[6]的研究表明，樣本經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融10次，與對(duì)照組差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中反復(fù)凍融3次的結(jié)果與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但反復(fù)凍融1次和5次的結(jié)果與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各處理組HCV RNA平均下降幅度不超過(guò)0.10 lg，處理組±95%CI不超過(guò)0.15 lg。

以往一些研究結(jié)果差異在一定程度上可能與樣本的選擇，如血清或血漿，乙二胺四乙酸抗凝或檸檬酸鹽抗凝等，HCVRNA檢測(cè)的方法、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、判斷標(biāo)準(zhǔn)及樣本量的不同有關(guān)。本研究選擇22份覆蓋HCVRNA高、中、低濃度的血漿樣本，通過(guò)不同的保存條件和不同的時(shí)間，可以總結(jié)出：血漿樣本在-20℃保存4周、4℃保存9d、室溫保存5 d和反復(fù)凍融5次，對(duì)HCV RNA檢測(cè)影響不明顯，但4 ℃保存12 d和室溫保存7 d后，RNA水平顯著降低，應(yīng)避免在這種條件和時(shí)間下保存和運(yùn)輸血漿。

[1]Zou S,Dorsey KA,Notari EP,et al.Prevalence,incidence,and residual risk of human immunodeficiency virus and hepatitis C virus infections among United States blood donors since the introduction of nucleic acid testing[J].Transfusion,2010,50(7):1495-1504.

[2]Halfon P,Bourlière M,Pénaranda G,et al.Real-time PCR assays for hepatitis C virus (HCV) RNA quantitation are adequate for clinical management of patients with chronic HCV infection[J].J Clin Microbiol,2006,44(7):2507-2511.

[3]劉長(zhǎng)利，任芙蓉，呂秋霜，等．不同處理和保存條件下體外HCV RNA穩(wěn)定性研究[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2006，14(6)：1238-1243．

[4]劉長(zhǎng)利，任芙蓉，呂秋霜，等．對(duì)丙型肝炎病毒核酸穩(wěn)定性的研究[J]．臨床輸血與檢驗(yàn)，2007，9(3)：217-221．

[5]Baleriola C,Johal H,Jacka B,et al.Stability of hepatitis C virus,HIV,and hepatitis B virus nucleic acids in plasma samples after long-term storage at -20 ℃ and -70 ℃[J].J Clin Microbiol,2011,49(9):3163-3167.

[6]Comert F,Aktas E,Terzi HA,et al.Evaluation of hepatitis C virus RNA stability in room temperature and multiple freeze-thaw cycles by COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2013,75(1):81-85.

[7]Gessoni G,Barin P,Frigato A,et al.The stability of hepatitis C virus RNA after storage at +4 degrees C[J].J Viral Hepat,2000,7(4):283-286.

[8]Sener K,Yapar M,Bedir O,et al.Stability of hepatitis C virus RNA in blood samples by TaqMan real-time PCR[J].J Clin Lab Anal,2010,24(3):134-138.

[9]Grant PR,Kitchen A,Barbara JA,et al.Effects of handling and storage of blood on the stability of hepatitis C virus RNA:implications for NAT testing in transfusion practice[J].Vox Sang,2000,78(3):137-142.

[10]José M,Curtu S,Gajardo R,et al.The effect of storage at different temperatures on the stability of Hepatitis C virus RNA in plasma samples[J].Biologicals,2003,31(1):1-8.

[11]José M,Gajardo R,Jorquera JI.Stability of HCV,HIV-1 and HBV nucleic acids in plasma samples under long-term storage[J].Biologicals,2005,33(1):9-16.

Stability of hepatitis C virus nucleic acid in plasma stored on different conditions*

LIUYue-yue，GAOJia-mei#，F(xiàn)ANXing-liang，DUJia-liang，LIUYan，GUOTai

△(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China)

Objective To investigate effects of different storage conditions and time on stability of HCV RNA.Methods Totally 22 plasma samples were stored at different conditions as bellow:-20 ℃ for 4 weeks;4 ℃ for 12 days;room temperature(20-25 ℃) for 7 days;5 freeze-thaw cycles.HCV RNA was determined by RT-PCR to investigate the stability of it.Results The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.14 lg and ±95%CI≤0.20 lg when samples were stored at -20 ℃ for 4 weeks.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.39 lg and ±95%CI≥-0.50 lg when samples were stored at 4 ℃ for 12 days.But ±95%CI≤0.24 lg when samples were stored at 4 ℃ less than 12 days.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.40 lg and ±95%CI≥ -0.53 lg when samples were stored at room temperature for 7 days.But ±95%CI≤0.29 lg when samples were stored at room temperature less than 7 days.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.10 lg and ±95%CI≤0.15 lg when samples were frozen and thawed for 5 times.Conclusion HCV RNA is stable in plasma samples stored at -20 ℃ for 4 weeks,4 ℃ for 9 days,room temperature for 5 days or after 5 freeze-thaw cycles.But HCV RNA concentration declined dramatically when samples were stored at 4 ℃ for 12 days and room temperature for 7 days.The storage and transportation should be avoided in these conditions.

hepatitis C； nucleic acids； stability

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題資助項(xiàng)目(2012ZX10004702)。

劉悅越，女，碩士，助理研究員，主要從事生物制品質(zhì)量研究。 # 同為第一作者。

△通訊作者,E-mail:guotai@nifdc.org.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.001

A

1672-9455(2015)03-0289-03

2014-07-04

2014-10-22)