于淑池，王 珮，許琳瑯，王海娟，周穩(wěn)平

(瓊州學(xué)院 食品學(xué)院，海南 三亞 572022)

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海南苦丁茶多糖的提取及對紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用研究

于淑池，王 珮，許琳瑯，王海娟，周穩(wěn)平

(瓊州學(xué)院 食品學(xué)院，海南 三亞 572022)

采用正交試驗優(yōu)化水提法提取海南苦丁茶中茶多糖，并研究了苦丁茶多糖在體外對人血紅細(xì)胞自氧化和H2O2所致紅細(xì)胞氧化溶血保護(hù)作用。結(jié)果表明：影響苦丁茶多糖提取率的因素主次關(guān)系為浸提溫度> 浸提時間>乙醇濃度>料液比。正交試驗最佳條件為：浸提溫度為85℃，乙醇濃度為75%，浸提時間為1.5h，料液比為1∶15，此條件下的多糖提取率為3.53%。海南苦丁茶多糖在體外能夠明顯抑制人血紅細(xì)胞自氧化溶血作用，隨著茶多糖濃度的增加抑制紅細(xì)胞的自氧化溶血作用也逐漸增強(qiáng)，茶多糖濃度為200μg/mL-400μg/mL時，溶血度下降趨勢平緩，當(dāng)濃度大于400μg /mL時溶血度迅速下降，抗氧化活性迅速上升，當(dāng)茶多糖濃度達(dá)到600μg /mL時與200μg/mL的Vc保護(hù)作用相近；茶多糖對H2O2所致紅細(xì)胞的溶血度也具有保護(hù)作用，隨著茶多糖濃度的增加，抑制H2O2所致紅細(xì)胞的氧化溶血作用也逐漸增強(qiáng)，茶多糖的保護(hù)作用均比相同濃度下的Vc溶液弱。

苦丁茶；茶多糖；正交試驗；紅細(xì)胞溶血

0 引言

海南苦丁茶屬冬青科的苦丁茶冬青種[1],為冬青科常綠喬木,主要分布于我國南方等省區(qū).是海南的特色名片,茶多糖 ( tea polysaccharide，簡稱 TPS)是茶葉中繼茶多酚之后發(fā)現(xiàn)的又一種重要的生理活性物質(zhì).研究表明,苦丁茶多糖具有良好的抗菌、降血脂、降血壓、清除自由基等作用[2-3].海南正規(guī)的苦丁茶生產(chǎn)企業(yè)約有存茶2000多噸.苦丁茶原料充足.具有極大的開發(fā)價值.茶葉的深加工與綜合利用是未來茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵所在.本課題通過正交設(shè)計,研究從海南苦丁茶中高效提取茶多糖的的工藝.采用紅細(xì)胞自氧化溶血、雙氧水誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血實驗來研究茶多糖的抗氧化活性.目前對苦丁茶多糖提取工藝研究的報道較多[4-6]，呂愛華等[7]還將茶多糖制成膠囊服用,彭曉輝[8]、楊軍國等[9]研究了苦丁茶多糖的降血糖作用,但苦丁茶對人血紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用研究未見報道,因此本課題的研究為海南苦丁茶的深加工開辟新的途徑,為苦丁茶的保健品開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海南苦丁茶(產(chǎn)于海南省五指山)：購自海南三亞南國超市,將苦丁茶在60℃烘箱干燥48h,用粉碎機(jī)將干燥后的苦丁茶粉碎,過60目篩,得到苦丁茶粉末備用.葡萄糖、濃硫酸、無水乙醇、乙醚、雙氧水、維生素C、三氯乙酸等，以上試劑均分析純.

1.2 儀器

SKP-01電熱恒溫干燥箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)、HWS-26超級恒溫水浴槽(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司)、FA2204B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)、TDL-80-2B離心機(jī)(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司)、HY-3多用振蕩器(金壇市恒豐儀器廠)、UV-2550紫外分光光度計(日本島津).

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用苯酚- 硫酸比色法測定糖的含量.分別取4、8、12、16、20、24、28μg/mL濃度的葡萄糖溶液 4mL于25mL試管中,加15%苯酚溶液2mL,98%濃硫酸10mL,靜置10min,攪拌均勻,20min后于490nm處,測各溶液的吸光值,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),溶液吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.吸光度(y)對葡萄糖質(zhì)量濃度(x)做回歸處理,得到回歸方程。Y=0.0393x+0.0076,R2=0.9902.擬合度良好.

1.3.2海南苦丁茶多糖的提取工藝流程

苦丁茶粉浸提液→水浴加熱→離心→取上清液→合并上清液→加入TCA脫色除蛋白→震蕩30min→離心10min→取上清液→合并上清液→加乙醇沉淀→離心10min→取沉淀的多糖→用無水乙醚與無水乙醇洗滌沉淀→定容顯色→測吸光值→計算多糖提取率[10].

1.3.3水浸提法對多糖提取率的影響

選取浸提時間(0.5、1、1.5、2、3h),浸提溫度(45、55、65、75、85℃),料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25),乙醇濃度(55、65、75、85、95%)進(jìn)行單因素實驗,計算多糖得率.

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選用標(biāo)準(zhǔn)L9(34)正交試驗表進(jìn)行試驗方案設(shè)計,其因素與水平設(shè)計見表1.

表1 正交試驗因素水平設(shè)計

1.4海南苦丁茶多糖對紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用

海南苦丁茶多糖對紅細(xì)胞自氧化和H2O2所致紅細(xì)胞氧化溶血的影響.

采用于淑池[11]的方法并有所改進(jìn),計算溶血度[12].

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 水浸提對海南苦丁茶多糖的單因素考察

2.1.1 浸提溫度對多糖提取率的影響 改變浸提溫度對多糖提取率的影響如圖1所示.其結(jié)果表明：不同浸提溫度對多糖率的影響比較大.隨溫度的升高,多糖提取率增大,在65℃時達(dá)到最大值,隨后又隨溫度的升高提取率降低.因此,浸提溫度65℃為最佳的工藝參數(shù).

圖1 浸提溫度對多糖提取率的影響

2.1.2 浸提時間對多糖提取率的影響 浸提時間單因素對多糖提取率的影響如圖2.由結(jié)果可得：在0.5-1.5h之間,提取率增幅較大,在1.5h之后增幅較小且不規(guī)律,在1.5h處和3h處各出現(xiàn)一個峰值,在3h處達(dá)最大值.因此,浸提時間3h為最佳.

圖2 浸提時間對多糖提取率的影響

2.1.3 料液比對多糖提取率的影響 其結(jié)果如圖3：料液比對多糖提取率的影響較大,在1∶15處提取率最高.因此,料水比1∶15為最佳.

圖3 料液比對多糖提取率的影響

2.1.4 乙醇濃度對多糖提取率的影響 其結(jié)果如圖4：乙醇濃度對多糖的提取率影響較小,但在95%的乙醇濃度下提取率明顯高于其他濃度.因此,乙醇濃度95%為最佳.

圖4 乙醇濃度對多糖提取率的影響

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取浸提時間,浸提溫度,浸提料液比,沉淀乙醇濃度為正交試驗的影響因素,進(jìn)行正交試驗及數(shù)據(jù)處理如表2：

表2 L9(34)正交試驗及極差分析

由極差分析得出影響主次效果為：A>C>B>D,因此,水浸提苦丁茶多糖提取率的最佳參數(shù)為A3B2C1D3,即浸提溫度為85℃,乙醇濃度為75%,浸提時間為1.5h，料液比為1∶15.此條件下的多糖提取率為3.53%.

2.3 苦丁茶多糖對紅細(xì)胞溶血的抑制作用

對照組與試驗組經(jīng)37℃水浴24h后,出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象,以對照組為100%溶血,計算各處理組溶血度.結(jié)果見表3.

表3 苦丁茶多糖對紅細(xì)胞自溶血的保護(hù)作用

注：試驗組與對照組比較**P<0.01

由表3可知,對照組溶血度為100%,苦丁茶多糖及Vc個組抑制紅細(xì)胞自氧化作用比較明顯,均為隨著濃度的增加溶血度逐漸降低,茶多糖在濃度為200-400μg/mL時,溶血度下降趨勢平緩,當(dāng)濃度大于400μg/mL溶血度迅速下降,抗氧化活性迅速上升,當(dāng)茶多糖濃度達(dá)到600μg/mL與200μg/mL的Vc抗氧化活性相近.Vc所呈現(xiàn)的趨勢較為明顯，經(jīng)T檢驗,茶多糖及Vc各劑量組與對照組比較存在極顯著性差異(P<0.01).

2.4 苦丁茶多糖對H2O2所致紅細(xì)胞溶血的抑制作用

正常組、對照組及實驗組于37℃水浴恒溫1h后,出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象,結(jié)果見表4.

表4 苦丁茶多糖對H2O2所致紅細(xì)胞溶血的抑制作用

注：正常組與對照組比較#P<0.05; 試驗組與對照組比較**P<0.01

由表4可知，茶多糖各濃度組均可抑制H2O2所致紅細(xì)胞的溶血.當(dāng)茶多糖濃度為600μg/mL時,抑制H2O2對紅細(xì)胞溶血的作用與200μg/mL的Vc相近,濃度越高茶多糖對H2O2所致紅細(xì)胞的溶血抑制作用也越強(qiáng).經(jīng)T檢驗,茶多糖各劑量組、Vc各組與對照組比較均存在極顯著性差異(P<0.01).

3 結(jié)論與討論

本研究采用熱水浸提法對海南苦丁茶多糖的提取工藝進(jìn)行了研究, 由單因素和正交試驗得出結(jié)論: 影響多糖提取率的主要是溫度,其次是浸提時間、乙醇濃度、料液比.正交試驗所獲得的優(yōu)化提取工藝條件為：浸提溫度為85℃,乙醇濃度為75%,浸提時間為1.5h,料液比為1∶15,多糖得率為3.53%.此法與施思等[13]苦丁茶多糖最大提取率4.71%稍有偏低,分析可能為苦丁茶產(chǎn)地不同使其多糖提取率受影響.黃敏桃等[14]認(rèn)為，不同產(chǎn)地整體對比中,廣西產(chǎn)地>廣東產(chǎn)地>海南產(chǎn)地.

在機(jī)體內(nèi)紅細(xì)胞是一種具有運輸O2及CO2作用的細(xì)胞,其膜內(nèi)的血紅蛋白使其功能的發(fā)揮成為可能,一旦細(xì)胞膜發(fā)生破壞,其內(nèi)部的血紅蛋白外溢,紅細(xì)胞被破壞其運輸能力便喪失[15].由于紅細(xì)胞膜易受到氧自由基的攻擊而使紅細(xì)胞膜的完整性發(fā)生破壞,導(dǎo)致溶血.H2O2是一種強(qiáng)氧化劑,可以破壞紅細(xì)胞,導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂紅蛋白溢出,茶多糖可以明顯抑制H2O2的這種作用.Vc是強(qiáng)抗氧化劑,在試驗中作為標(biāo)準(zhǔn)對照,將茶多糖的抗氧化活性與之比較可以達(dá)到顯著對比效果.陳朝銀等[16]發(fā)現(xiàn)普洱茶多糖的抗氧化性與Vc相近.苦丁茶多糖對紅細(xì)胞溶血的抑制作用的實驗表明,濃度越高與Vc的抗氧化活性越接近.結(jié)論：苦丁茶多糖在體外能夠明顯抑制人血紅細(xì)胞自氧化溶血作用以及雙氧水所致紅細(xì)胞氧化溶血作用,顯示良好的應(yīng)用價值.

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Extraction Technology of Hainan Kuding Tea Polysaccharides and Its Protective Effects on Erythrocyte Hemolysis

YU Shu-chi，WANG Pei ，XU Lin-lang，WANG Hai-juan，ZHOU Wen-ping

(School of Food Sciences, Qiongzhou University, Sanya Hannan, 572022, China)

Polysaccharides is extracted from Hainan Kuding tea by using the water extraction method with the technology optimized by designing the orthogonal tests. The protective effects of Kuding tea on hemolysis of red blood cells and H2O2induced hemolysis are further studied. The result shows that the order of the elements affecting the extraction rate is temperature>time> ethanol concentration> ratio of material to solvent. The perfect condition for the extraction is Temperature: 85℃, Ethanol Eoncentration: 75%, Time: 1.5h, and Ratio of Material to Solvent: 1∶1.5. Under this condition the extraction ratio of Polysaccharides is 3.53%. Polysaccharides extracted from Hainan Kuding tea has an obvious inhibiting effect on the hemolysis of red blood cells. The inhibiting effect increases with the increase of the density of Polysaccharides. The hemolysis effect declines slowly and steadily when the range of density of Polysaccharides is within 200μg/mL～400μg/mL. But when the density is greater than 400 g/mL, the hemolysis effect declines rapidly and its antioxidant activity increases rapidly. The Vc antioxidant activities possess similar effects when density of Polysaccharides reach 600μg /mL and 200μg/m. Polysaccharides extracted from Hainan Kuding tea has a protective effect on the hemolysis of red blood cells induced by H2O2. The inhibiting effect of the hemolysis of red blood cells also increases with the increase of the density of Polysaccharides. With the same densities, the antioxidant activity of Polysaccharides is weaker than Vc solution.

Kuding tea; tea polysaccharide; orthogonal test; red blood cell haemolysis

2015-04-07

三亞市院地科技合作項目(2015YD42)；瓊州學(xué)院2014年度實驗室開放項目(2014QYKY009)

于淑池(1966-)女，河北省平泉縣人，滿族，瓊州學(xué)院食品學(xué)院副教授，研究方向為生物活性物質(zhì).

R284. 1

A

1008-6722(2015) 05-0050-06

10.13307/j.issn.1008-6722．2015．05．12