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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

防齲基因疫苗pVAX1-SPG在BALB/c小鼠免疫部位的原位表達(dá)

孫天瞳1，劉建國1,2，姜晶1，王偉1，亓鵬1，白國輝1,2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院，貴州 遵義563099；2.貴州省高等學(xué)校口腔疾病研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察防齲基因疫苗 pVAX1-SPG免疫BALB/c小鼠后的原位表達(dá)。方法 重組質(zhì)粒pVAX1-SPG經(jīng)頜下腺區(qū)皮下注射、股四頭肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠,免疫組化技術(shù)觀察目的蛋白SpaP-P/GbpA-GBD在免疫部位的表達(dá)情況。結(jié)果 小鼠雙側(cè)頜下腺組織內(nèi)均可見目的蛋白的彌漫性表達(dá)，尤以導(dǎo)管區(qū)域表達(dá)強(qiáng)烈，導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿內(nèi)呈強(qiáng)陽性染色；股四頭肌肌纖維胞漿和肌膜下方陽性染色，呈不均勻的受限表達(dá)；鼻腔黏膜上皮下方的固有層與結(jié)締組織中可見呈淺棕黃色染色的目的蛋白表達(dá)。結(jié)論 重組質(zhì)粒pVAX1-SPG能夠在BALB/c小鼠的免疫部位正確表達(dá)目的蛋白。

[關(guān)鍵詞]基因疫苗；變異鏈球菌；齲齒；表面蛋白；葡聚糖結(jié)合蛋白

齲病是人類最常見的細(xì)菌感染性疾病，嚴(yán)重危害著人群的口腔健康。變異鏈球菌族細(xì)菌，主要是變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)和表兄鏈球菌(Streptococcus sobrinus)被認(rèn)為是最重要的致齲菌。其在牙面的黏附、聚集和產(chǎn)酸，是齲病發(fā)生的先決條件[1-2]。S.mutans的毒力因子表面蛋白(surface protein antigen，SpaP)在介導(dǎo)S.mutans對(duì)牙面的蔗糖非依賴性黏附中起著關(guān)鍵作用，另一毒力因子葡聚糖結(jié)合蛋白(glucan binding proteins A ,GbpA)通過與細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖-葡聚糖結(jié)合介導(dǎo)細(xì)菌在牙面的黏附和聚集，參與了S.mutans在獲得性膜上的蔗糖依賴性粘附。

本課題組前期構(gòu)建了編碼S.mutansSpaP的P區(qū)(SpaP-P)和GbpsA功能區(qū)葡聚糖結(jié)合區(qū)(GBD)結(jié)構(gòu)基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SPG，本研究進(jìn)一步將該重組質(zhì)粒經(jīng)頜下腺區(qū)皮下注射、股四頭肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠，觀察重組蛋白SpaP-P/GbpA-GBD在動(dòng)物免疫部位的表達(dá)，為后續(xù)觀察該基因疫苗的免疫效果和尋找理想的免疫途徑的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑重組質(zhì)粒pVAX1-SPG (本課題組前期構(gòu)建)；真核載體質(zhì)粒pVAX1(美國Invitogen公司產(chǎn)品)。兔抗SpaP多克隆抗體、兔抗GBD多克隆抗體(本課題組前期制備)，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國Amresco公司)，質(zhì)粒純化試劑盒(美國Omega公司)。

1.2動(dòng)物分組6周齡雄性BALB/c小鼠18只[購自重慶市騰鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(渝)20070003]，體重(20±2) g，隨機(jī)分為6組，每組3只。實(shí)驗(yàn)組用pVAX1-SPG免疫，對(duì)照組用pVAX1(載體質(zhì)粒)免疫，均采取頜下腺區(qū)皮下注射、股四頭肌注射和鼻腔黏膜滴注3種免疫方式。

1.3動(dòng)物免疫動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分別采用雙側(cè)頜下腺區(qū)皮下注射、股四頭肌注射和鼻腔黏膜滴注方式免疫小鼠1次，質(zhì)粒劑量為100 μg/只(每側(cè)50 μg)。

1.4標(biāo)本的采集和處理免疫3 d后斷頸處死動(dòng)物。迅速收集免疫部位的頜下腺和股四頭肌以及鼻腔黏膜標(biāo)本,多聚甲醛固定12~16 h，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

1.5目的蛋白的原位表達(dá)檢查采用免疫組織化學(xué)染色SP法檢測(cè)目的蛋白的原位表達(dá)。石蠟切片脫蠟后將載玻片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的微波用塑料盒中，微波爐加熱后每張切片滴加1滴3%過氧化氫去離子水，室溫孵育10 min，每張切片滴加1滴正常非免疫動(dòng)物血清，室溫放置15 min，每張切片滴加(1∶50)的一抗(兔抗SpaP多克隆抗體或兔抗GBD多克隆抗體)50 μL，4 ℃過夜；次日洗片后每張切片滴加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫10 min；洗片后每張切片滴加1滴鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，每張切片滴加30 μL DAB顯色，顯微鏡下控制染色，當(dāng)組織或目標(biāo)細(xì)胞陽性表達(dá)部位為深棕色或棕黃色時(shí)終止顯色。

2結(jié)果

2.1頜下腺區(qū)注射pVAX1-SPG免疫后在小鼠兩側(cè)頜下腺內(nèi)均可見目的蛋白呈彌漫性表達(dá)，尤以導(dǎo)管區(qū)域表達(dá)強(qiáng)烈，導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿內(nèi)呈強(qiáng)陽性染色(見圖1A)，對(duì)照組pVAX1免疫后在小鼠兩側(cè)頜下腺內(nèi)均未見目的蛋白表達(dá)(見圖1B)。

2.2股四頭肌注射pVAX1-SPG免疫后在小鼠股四頭肌肌纖維胞漿和肌膜下方可見目的蛋白染色陽性，呈不均勻的受限表達(dá)(見圖1C)，對(duì)照組pVAX1免疫后均未見目的蛋白表達(dá)(見圖1D)。

2.3鼻腔黏膜滴注pVAX1-SPG免疫組在鼻腔黏膜上皮下方的固有層與結(jié)締組織中可見目的蛋白呈淺棕黃色染色(見圖1E)，對(duì)照組pVAX1免疫后均未見目的蛋白表達(dá)(見圖1F)。

A:pVAX1-SPG頜下腺區(qū)注射組；B:pVAX1頜下腺區(qū)注射組；C:pVAX1-SPG股四頭肌注射組；D:pVAX1股四頭肌注射組；E:pVAX1-SPG鼻腔黏膜滴注組；F:pVAX1鼻腔黏膜滴注組。圖1　目的蛋白在免疫部位的表達(dá)(SP染色,×400)

3討論

齲病是人類最常見的口腔感染性疾病，起始于變異鏈球菌族細(xì)菌在牙面的黏附和聚集。表面蛋白(SpaP)、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)和葡聚糖結(jié)合蛋白(GbpA)是S.mutans的主要黏附因子，也是目前研究較多、生物學(xué)功能和分子結(jié)構(gòu)相對(duì)明確的毒力因子，被認(rèn)為是理想的防齲疫苗候選抗原，針對(duì)這些毒力因子設(shè)計(jì)的防齲基因疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。

SpaP介導(dǎo)了S.mutans對(duì)牙面的非蔗糖依賴性黏附，SpaP的P區(qū)(SpaP-P)富含豐富的T、B細(xì)胞表位，能夠有效的誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答[5]。GbpA在S.mutans參與的蔗糖依賴性口腔菌斑生物膜形成中起著關(guān)鍵的作用。研究表明GbpA的葡聚糖結(jié)合區(qū)(GBD)為介導(dǎo)S.mutans黏附的重要功能區(qū)，有較好的免疫原性[6]。由于SpaP和GbpA均參與口腔菌斑生物膜形成，將這兩個(gè)毒力因子的功能區(qū)SpaP-P與GBD的基因共同克隆到同一真核表達(dá)載體構(gòu)建嵌合體防齲疫苗，從理論上講，將有效阻止S.mutans對(duì)牙面的非蔗糖依賴性黏附和S.mutans與其它口腔鏈球菌的相互黏附(即致齲菌的聚集)，干擾致齲性牙菌斑生物膜的形成，降低齲病的發(fā)生率和患齲程度。

用作基因疫苗的真核表達(dá)質(zhì)粒能否有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，首先要看真核表達(dá)質(zhì)粒能否在機(jī)體內(nèi)正確表達(dá)目的蛋白。許多研究已經(jīng)證明基因疫苗免疫后能夠在肌肉和黏膜組織表達(dá)重組目的蛋白。Tadokoro 等[7]經(jīng)鼻接種預(yù)防艾滋病基因疫苗后，在局部淋巴結(jié)、肝、肺、腎等組織中檢測(cè)到重組質(zhì)粒的存在，在肺部檢測(cè)到特異蛋白。樊明文等[8]通過肌注和頜下腺周注射針對(duì)變異鏈球菌表面蛋白功能區(qū)A區(qū)和P區(qū)的防齲基因疫苗pCIA-P免疫大鼠，觀察到重組蛋白PAcA-P能夠在免疫部位表達(dá)。劉暢等[9]報(bào)道針對(duì)SpaP和GTF 及免疫佐劑細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4的融合防齲基因疫苗pGJA-P經(jīng)鼻腔黏膜滴注途徑免疫小鼠后在卵巢、肝、胃腸、脾、腎、胸腺、心臟、肺、頜下腺、腦、接種部位組織及其引流淋巴結(jié)均檢測(cè)到重組質(zhì)粒。免疫第1天在接種部位可觀察到陽性表達(dá)，而且，第1天的mRNA表達(dá)水平高于第3、7天和引流淋巴結(jié)。管曉燕等[10]將針對(duì)GTF功能區(qū)CAT的重組質(zhì)粒pVAX1-gtf/CAT經(jīng)水凝膠包裹并以口服等不同免疫途徑免疫新西蘭大白兔后，在動(dòng)物的小腸黏膜、鼻腔黏膜、頜下腺和骨骼肌檢測(cè)到重組蛋白的表達(dá)，能夠有效的誘導(dǎo)機(jī)體的體液和黏膜免疫應(yīng)答。

課題組前期研制了僅針對(duì)SpaP的功能區(qū)P區(qū)(SpaP-P)或GbpsA功能區(qū)GBD的單價(jià)防齲基因疫苗，經(jīng)體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)和免疫小鼠、大鼠和兔等系列研究證實(shí)其具有較好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體的體液和黏膜免疫應(yīng)答，在一定程度上減少大鼠齲齒的發(fā)生率[11-14]。在此基礎(chǔ)上研制了針對(duì)SpaP-P和GBD的雙價(jià)防齲基因疫苗pVAX1-SPG，希望通過兩個(gè)抗原的協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)防齲基因疫苗的免疫原性，提高免疫效果[15]。本研究將該重組質(zhì)粒經(jīng)頜下腺區(qū)皮下注射、股四頭肌注射和鼻腔黏膜滴注等不同途徑免疫BALB/c小鼠，觀察重組質(zhì)粒pVAX1-SPG能否在動(dòng)物免疫部位表達(dá)重組目的蛋白SpaP-P/GbpA-GBD，為后續(xù)觀察該基因疫苗的免疫效果和尋找理想的免疫途徑的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。研究結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒pVAX1-SPG經(jīng)股四頭肌注射、頜下腺周注射以及鼻腔黏膜滴注三種途徑免疫BALB/c小鼠后，均能夠在免疫部位表達(dá)。目的蛋白在股四頭肌肌纖維胞漿和肌膜下方呈不均勻的受限表達(dá)，可能是由于肌內(nèi)膜、肌中膜和肌束膜等肌纖維的物理屏障阻擋了質(zhì)粒的進(jìn)入，使肌肉組織最多只有1%~2%的肌纖維細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，也可能是由于細(xì)胞的異質(zhì)性，不同的細(xì)胞表達(dá)蛋白的能力不同所致[16]。經(jīng)頜下腺周注射免疫后，在導(dǎo)管細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，尤以導(dǎo)管區(qū)域表達(dá)強(qiáng)烈，這可能與頜下腺周圍皮下富含樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞有關(guān)[17-18]。經(jīng)鼻腔黏膜滴注免疫后在黏膜上皮下方的固有層與結(jié)締組織中可見目的蛋白的表達(dá)，其機(jī)制目前還不十分清楚。嵌合目的蛋白在免疫部位組織中的表達(dá)，說明質(zhì)粒被攝取并經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程正確表達(dá)了抗原蛋白分子，為觀察該防齲基因疫苗的免疫原性和防齲效果的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以及尋找有效的免疫途徑的研究奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿2015-10-02;修回2015-11-08]

(編輯：王靜)

The expression of anti-caries gene vaccine pVAX1-SPG in BALB/c mice in situ

SunTiantong1,LiuJianguo1,2,JiangJing1,WangWei1,QiPeng1,BaiGuohui1,2

(1. The School of Stomatology, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China；2.The Special Key Laboratory of Oral Diseases Research, Higher Education Institution in Guizhou Province,The Key Laboratory of Oral Diseases Research in Zunyi City, Zunyi Guizhou 563099,China)

[Abstract]Objective To observe the expression of the eukaryotic plasmid pVAX1-SPG as anti-caries gene vaccine, including P domain(SpaP-P) of surface protein antigen (SpaP) and glucan binding domain(GBD) of glucan binding protein A(GbpA)ofstreptococcusmutansin situs.Methods BALB/c mice were immunized with plasmid pVAX1-SPG by three different ways including the intranasal immunization, the quadriceps injection and the submandibular gland-targeted injection.Immunohistochemistry technique was used to detect the expression of recombinant protein SpaP-P/GbpA-GBD.Results The diffused expression of target protein was detected in both sides of submandibular glands,particularly in ducts area with strong positive stain in cytoplasm of duct cells; positive stain in cytoplasm of muscle fiber and under the sarcolemma,but the expression was uneven. The positive light brown stain can be observed in lamina propria and connective tissue of nasal mucosa.Conclusion The fusion protein SpaP-P/GbpA-GBD can be correctly expressedinvivo.

[Key words]gene vaccine；streptococcus mutants；dental caries；surface protein antigen；glucan binding protein A

[中圖法分類號(hào)]R781.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)06-0581-03

[通信作者]劉建國，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：齲病的病因與防治，E-mail:liujg_001@163.com。

[基金項(xiàng)目]貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(NO：黔科合人字[2005]0509)；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(NO：黔科合人才團(tuán)隊(duì)[2013]4026)；省市科技合作專項(xiàng)資金項(xiàng)目(NO：省市科合[2014]41)；貴州省高等學(xué)校特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(NO：黔教合KY字[2013]109)。