摘要：為了給無籽羅漢果優(yōu)良品種的選育提供分子生物學(xué)依據(jù)，利用RAPD標(biāo)記對28份羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株進(jìn)行遺傳背景分析。結(jié)果表明，羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株的遺傳背景存在一定的豐富性，但大多遺傳相似性系數(shù)較大，遺傳距離較近?？偟膩碚f，羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株遺傳背景的復(fù)雜性較低，應(yīng)該盡快采取相應(yīng)措施，進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，豐富無籽羅漢果親本的遺傳背景。

關(guān)鍵詞：羅漢果；二倍體；三倍體；遺傳背景；RAPD

中圖分類號(hào)： S567.903文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0241-03

收稿日期：2014-04-15

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃 （編號(hào)：2011BAI01B03）；國家自然科學(xué)基金 （編號(hào)：81373914）；廣西自然科學(xué)基金（編號(hào)：2013GXNSFDA019021、2013GXNSFBA019170）

作者簡介：韋榮昌（1983—），男，廣西梧州人，博士，助理研究員，主要從事生藥學(xué)研究。E-mail：wrc830612@163.com。羅漢果[Siraitia grosvenorii （Swingle） C. Jeffrey]是雌雄異株的葫蘆科（Cucurbitaceae）羅漢果屬多年生藤本植物[1]，為我國南方特有的珍貴藥用植物和甜料植物，主產(chǎn)于廣西壯自治區(qū)永福、臨桂、龍勝、興安和融安等地[2]。羅漢果果實(shí)含多種甜苷，其中甜苷V為世界上最強(qiáng)的非糖甜味物質(zhì)之一，為蔗糖甜度的300～400倍，是一種綜合性狀極佳的天然甜味劑，廣泛應(yīng)用于食品、藥品和保健品中，適合所有人群長期食用，是肥胖者、糖尿病人和高血壓患者的理想糖替代品[3-4]。多倍體羅漢果可大幅提高根、莖、葉、果實(shí)等部位的生物量和產(chǎn)量，其中三倍體羅漢果還具有無籽的特性，大大提高了整果利用率和甜苷提取收得率，對整個(gè)羅漢果產(chǎn)業(yè)具有里程碑的意義[5]。羅漢果三倍體雌株經(jīng)二倍體雄株授粉后所結(jié)的果實(shí)即為無籽羅漢果。本研究利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)[6-9]探討羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株的遺傳背景，為無籽羅漢果優(yōu)良品種的選育提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自廣西桂林興安縣漠川鄉(xiāng)的羅漢果種植基地，總共采集到28份材料：二倍體雄株7份，三倍體雌株21份，利用二倍體（或四倍體）父本花粉對四倍體（或二倍體）母本柱頭進(jìn)行人工授粉雜交獲得（表1）。每份材料選取生長狀況良好的羅漢果單株3～5株，采集約10張健康成熟的葉片并混合成該份材料的樣品，用硅膠干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室中待用。

1.2RAPD分析

采用改良CTAB（2×）法[10]提取羅漢果葉片的總DNA。

引物篩選：從材料中隨機(jī)選出6份樣品（包含2x、4x）進(jìn)行引物篩選，從200條RAPD引物中篩選出20條擴(kuò)增反應(yīng)穩(wěn)定、條帶清晰、具有多態(tài)性的引物，并用于所有材料的擴(kuò)增。20個(gè)RAPD引物名稱、序列見表2。

瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物：將擴(kuò)增產(chǎn)物置于1.5 %瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠上所加電壓不超過5 V/cm，用 Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker （MBI Fermentas公司）作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對照，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色20～30 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照、記錄。

RAPD為顯性標(biāo)記，同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，相同遷移位置上有擴(kuò)增條帶記錄為1，無擴(kuò)增條帶記錄為0，構(gòu)建0-1原始矩陣。僅清晰、穩(wěn)定、可分辨的并且長度在400～2 000 bp范圍內(nèi)的ISSR擴(kuò)增條帶才被記錄。用AFLP-SURV version 1.0[12]計(jì)算材料間遺傳距離D，按D=-lnⅠ計(jì)算Nei & Li遺傳相似性系數(shù)；用NTSYS-pc version 2.02[13]軟件的UPGMA（unweighted pair group method using arithmatic average）方法進(jìn)行聚類分析；用GenAIEx version 6.3[14]進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

2結(jié)果與分析

2.1多態(tài)性分析

用20個(gè)RAPD引物對28份材料的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)2次，2次擴(kuò)增產(chǎn)物重復(fù)性好且穩(wěn)定，擴(kuò)增得到的總條帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)見表2。20個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)的范圍為 6～17條，共同帶在1～8條內(nèi)，多態(tài)性條帶數(shù)范圍為3～13條，多態(tài)性百分比為25.00%～88.89%，且由總計(jì)的結(jié)果可知，擴(kuò)增總條帶數(shù)為239條（平均每個(gè)引物11.95條），其中最多，為17條；引物S170得到的條帶最少，為6條。其中，引物S411的擴(kuò)增圖譜見圖1。此外，在不同羅漢果品種間存在的多態(tài)性條帶可作為鑒定品種的特征帶。

2.2遺傳相似性系數(shù)及遺傳距離

28份材料間的相似性系數(shù)變化范圍為0.691 0～0.920 6，其中F302與M202間的相似性系數(shù)最低（0.691 0），遺傳距離最高（0.369 6）；而F305與F306間的相似性系數(shù)最高（0.920 6），遺傳距離最小（0.082 7）。

2.3聚類分析

從圖2可看出，F(xiàn)305和F306直接聚為一類，具有很高的相似性系數(shù)，兩者距離最近；F321獨(dú)成一支，與其余材料相距較遠(yuǎn)；基本上相似性系數(shù)較高的材料排列并聚為一類。

2.4雙變量主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）是基于Nei & Li遺傳距離及相應(yīng)的相似性系數(shù)進(jìn)行的。因此，主坐標(biāo)分析圖中各個(gè)個(gè)體（品種）間的位置關(guān)系反映了它們在遺傳上的相似性。由于每份試驗(yàn)材料都是通過選取生長狀況良好的羅漢果單株3～5株，共采集約10張健康成熟葉片混合而成的，因此這28份材料的主坐標(biāo)分析可看作“雙變量主坐標(biāo)分析”（double principal coordinate analysis，DPCoA：一種將物種與物種之間差異考慮到群體間相互關(guān)系的測度之中的排序方法）[15-16]。通過RAPD標(biāo)記對28份材料進(jìn)行DPCoA排序發(fā)現(xiàn)，前3個(gè)主坐標(biāo)的方差貢獻(xiàn)率分別為26.81%、21.86%endprint

和17.60%，相對應(yīng)的累積貢獻(xiàn)率分別為26.81%、48.67%和66.27%。一般認(rèn)為，如果前3個(gè)主要特征向量的方差占總方差的40%以上，則排序效果是滿意的[17]，本試驗(yàn)結(jié)果 28 份材料的前3個(gè)主要特征向量的方差累積貢獻(xiàn)率高達(dá)6627%，說明降維效果較好。因此，保留DPCoA的前二軸對28份材料進(jìn)行排序分析，應(yīng)用GenAIEx version 6.3獲取坐標(biāo)軸特征值及樣品特征向量，并據(jù)此劃分出28份不同材料在DPCoA前二軸空間中的排序圖見圖3。

由Proj劃分而得的28份材料在PCoA排序圖中空間分布十分明顯，除F316和F318有部分交叉重疊外，其余樣品間均無交叉重疊現(xiàn)象。PCoA排序圖把28份材料分為三大類。第一大類位于A區(qū)間，其中三倍體雌株4份（F312、F313、F320、F321），二倍體雄株2份（M201、M204）。第二大類位于B和第D區(qū)間，其中只包括三倍體雌株12份（F301、F302、F303、F304、F305、F306、F307、F308、F309、F310、F311、F314）。第三大類位于C區(qū)間，其中只包括三倍體雄株3份（F316、F318、F319）、二倍體雄株5份（M202、M203 、M205、M206 M207）。

比較圖2和圖3可知，對28份材料所進(jìn)行的親緣關(guān)系聚類分析和雙變量主坐標(biāo)分析的結(jié)果基本上是一致的，雌株和雄株間的距離相對較近聚在一起，而雙變量主坐標(biāo)分析能從多個(gè)方向、多個(gè)層面更直觀和準(zhǔn)確地反映材料間的遺傳關(guān)系。

3結(jié)論與討論

3.1羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株的RAPD相關(guān)遺傳

根據(jù)RAPD分析結(jié)果可知，有的材料之間雖然是不同的種質(zhì)，但遺傳相似性系數(shù)較高，說明它們的親緣關(guān)系近；如F315因?yàn)橛蒒ongyuan B6與M204株系雜交而成，所以與M204關(guān)系較近，其相似性系數(shù)高達(dá)0.816 3。此外，在三倍體雌株中，如果其親本相同或相似性系數(shù)較高，由于子代繼承了親本一定的遺傳物質(zhì)，因而子代間的相似性系數(shù)也會(huì)較高，如F318和F319，由于其母本都是Yongqing 1，因此其相似性系數(shù)高達(dá)0.912 3；而因?yàn)镕305和F310也都為同一父本M205，所以其相似性系數(shù)也高達(dá)0.858 0。

3.2羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株的合理組配

F302與M202間的相似性系數(shù)僅為0.6910，還有M201與F302、F309及F312與M207間的相似性系數(shù)都僅為0.716 1，遺傳距離較大；而且M202與母本間的相似性系數(shù)均在 0.6～0.7 之間。因此，初步推測羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株中最適合作雌雄組配的是F302與M202，其次是F302與M204、F309與M204、F312與M207。

值得指出的是，雖然羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株的遺傳背景存在一定的復(fù)雜性，但大多遺傳相似性系數(shù)較大，遺傳距離較近，應(yīng)該盡快采取相應(yīng)措施，進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，豐富三倍體雌株和二倍體雄株的遺傳背景，為無籽羅漢果優(yōu)良品種的選育奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。endprint