摘要：選取1 d健康無免疫肉鴨480羽，隨機(jī)分成A、B、C、D 4組，每組120羽。B組、C組、D組在10 d分別免疫0.5、0.8、1.0 mL H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗，A組為非免疫對照組。用HI方法檢測母源抗體、免疫抗體，根據(jù)母源抗體、免疫抗體消長規(guī)律，探討H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗的合理免疫程序。結(jié)果顯示：7 d之前，鴨群中90%以上的個(gè)體HI效價(jià)在4 log2及以上，獲得的母源抗體可以有效保護(hù)鴨群；14 d時(shí)，鴨群僅有56.7%的個(gè)體有保護(hù)性抗體；21 d還能夠檢測到極低的母源抗體，鴨群中6.7%的個(gè)體有一定的保護(hù)力；28 d之后，鴨群所有個(gè)體的HI效價(jià)均在4 log2以下，鴨群已經(jīng)喪失對禽流感病毒的抵抗力。

關(guān)鍵詞：肉鴨；H5N1高致病性禽流感；母源抗體；免疫抗體；消長動(dòng)態(tài)；免疫程序；血凝抑制試驗(yàn)

中圖分類號： S852.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0216-02

收稿日期：2014-02-23

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號：122102110022）。

作者簡介：馬超鋒（1981—），男，河南禹州人，碩士研究生，獸醫(yī)師，主要從事重大動(dòng)物疫病防控研究。E-mail：machaofeng5@163.com。河南省信陽地區(qū)河網(wǎng)密布，非常適合養(yǎng)殖鴨鵝等水禽。近年來，信陽地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展迅猛，飼養(yǎng)量、存欄量逐年增長。肉鴨因其具有飼養(yǎng)周期短、成本低、出欄早等優(yōu)點(diǎn)，養(yǎng)殖規(guī)模在信陽市各縣區(qū)逐步擴(kuò)大。目前，全市肉鴨存欄量已達(dá)1 800萬羽，年出欄量達(dá)5 000萬羽，均居河南省首位。隨著肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鴨病尤其是病毒性疾?。單?、鴨病毒性肝炎、鴨副黏病毒等）流行日趨嚴(yán)重，特別是禽流感對肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的打擊幾乎是毀滅性的。禽流行性感冒簡稱禽流感（avian influenza，AIV），是由禽流感病毒引起的1種人畜禽共患的傳染病。AIV根據(jù)其對家禽致病力的不同分為3種，即高致病性、低致病性、無致病性。H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）是嚴(yán)重危害禽類的病原之一，對人類健康威脅較大，該亞型禽流感病毒是目前發(fā)現(xiàn)的禽流感病毒中感染性最強(qiáng)、致死率最高、流行范圍最廣的病毒，已在多個(gè)國家發(fā)生流行，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]?，F(xiàn)階段，疫苗接種仍是我國控制禽流感的主要措施之一[3]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部及河南省畜牧局的要求，信陽地區(qū)從2012年5月開始，使用H5N1新型禽流感Re-6株疫苗對水禽進(jìn)行防疫[4]。養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)周期內(nèi)何時(shí)免疫高致病性禽流感疫苗、劑量多少，國內(nèi)尚無相關(guān)研究。為探討重組禽流感病毒滅活疫苗（H5NI亞型，Re-6株）對肉鴨的免疫效果，根據(jù)國家強(qiáng)制免疫計(jì)劃及前人的研究，本研究采用不同劑量疫苗對相同日齡肉鴨進(jìn)行免疫接種，并監(jiān)測抗體的消長規(guī)律，以制定合理的肉鴨免疫程序，旨在為預(yù)防、控制禽流感提供參考。

1材料與方法

1.1材料

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）由遼寧益康生物股份有限公司提供，批號：20130801。禽流感H5亞型（Re-6株）血凝抑制試驗(yàn)診斷抗原（批號：2013005）、禽流感H5亞型（Re-6株）陰陽性血清（批號：2013004）。采集2～3羽無禽流感及新城疫等抗體的健康公雞自行配制1%雞紅細(xì)胞懸液。1日齡健康無免疫肉鴨480羽（河南省潢川縣華英集團(tuán)某飼養(yǎng)場專人飼養(yǎng)）。將雛鴨隨機(jī)分成A、B、C、D 4組，每組120羽，A組為非免疫對照組，其余各組均為試驗(yàn)組。B組、C組、D組于10日齡分別免疫0.5、0.8、1.0 mL重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）。

1.2儀器

Eppendorf 10～1 000 μL單道移液器及25～300 μL多道移液器（德國Eppendorf公司），303系列電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海樹立儀器儀表有限公司），TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1采樣A、B、C、D 4組分別在1、7、14、21、28、35、42日齡通過翅靜脈采血，每組隨機(jī)抽取30羽采其血樣，每羽1～2 mL，分離血清后冷凍保存?zhèn)錂z。

1.3.2檢測采用血凝（HA）及血凝抑制試驗(yàn)（HI）進(jìn)行禽流感抗體檢測，按照GB/T 18936—2003 《高致病性禽流感診斷技術(shù)》規(guī)定的方法進(jìn)行。禽流感病毒血凝試驗(yàn)抗體檢測方法判定標(biāo)準(zhǔn)：以完全抑制4單位抗原的最高血清稀釋倍數(shù)為該血清的HI效價(jià)。當(dāng)陽性對照血清的HI效價(jià)與已知效價(jià)誤差不超過1個(gè)滴度，陰性對照血清的HI效價(jià)不高于2 log2時(shí)，試驗(yàn)方可成立。被檢血清HI效價(jià)≤3 log2判為陰性；效價(jià)=4 log2判為可疑（可疑樣品應(yīng)重檢，重檢效價(jià)≥4 log2 判為陽性，≤3 log2判為陰性）；效價(jià)≥5 log2判為陽性。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用算術(shù)平均數(shù)表示HI效價(jià)，采用抗體合格率表示群體免疫合格情況，群體免疫抗體陽性率達(dá)到70%判定為群體合格。采用one-way ANOVA分析差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1不同日齡肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗母源抗體檢測情況

由表1可知，雛鴨母源抗體效價(jià)在1 d最高，平均值達(dá) 66 log2，保護(hù)力較好；隨著日齡增加，母源抗體開始下降，至14 d，HI平均值為3.87 log2，保護(hù)作用大大降低；28 d鴨群基本無母源抗體，已起不到保護(hù)作用。

2.2不同日齡肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗保護(hù)性母源抗體群體合格率

由圖1可見，雛鴨1 d時(shí)，抗體合格率為96.7%；7 d時(shí)90%的個(gè)體達(dá)到保護(hù)要求；14 d時(shí)，30羽雛鴨中11羽抗體效價(jià)在4log2以下，抗體合格率下降至56.7%；21 d時(shí)只有2羽在4log2以上，鴨群保護(hù)率為6.7%；28 d以后，整個(gè)鴨群無有效禽流感保護(hù)性抗體。endprint

2.3H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗試驗(yàn)組不同日齡肉鴨免疫抗體消長情況

由圖2、圖3可見，B組、C組、D組HI效價(jià)均值及抗體合格率均在14 d達(dá)到最低值，此后逐漸上升。對B組、C組、D組的HI效價(jià)均值進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)分析，P=0.468>0.05，差異不顯著；對B組、C組、D組的抗體合格率進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)分析，P=0.665>0.05，差異不顯著，就數(shù)值而言C組稍好。

3結(jié)論與討論

3.1肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗母源抗體消長規(guī)律

研究表明，種鴨產(chǎn)生的免疫抗體可以通過卵黃傳遞給雛鴨，起到天然被動(dòng)免疫的作用，保護(hù)雛鴨免受禽流感病毒的侵襲[5]。當(dāng)HI效價(jià)≥4 log2時(shí)，可以保護(hù)鴨體免受禽流感野毒感染。本研究表明，7 d之前，鴨群中90%以上的個(gè)體HI效價(jià)在4 log2及以上，獲得的母源抗體可以有效保護(hù)鴨群；14 d時(shí)，鴨群僅有56.7%的個(gè)體有保護(hù)性抗體；21日齡還能夠檢測到極低的母源抗體，鴨群中6.7%的個(gè)體有一定的保護(hù)力；28 d之后，鴨群所有個(gè)體的HI效價(jià)均在4 log2以下，鴨群已經(jīng)喪失對禽流感病毒的抵抗力。

3.2肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗免疫程序

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5NI亞型，Re-6株）是農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局根據(jù)病毒流行病學(xué)監(jiān)測情況、疫苗評估結(jié)果以及專家評審意見授權(quán)疫苗廠家生產(chǎn)的用于防控水禽禽流感的產(chǎn)品。家禽日齡及品種不同，對疫苗免疫的敏感性也不一致，HI抗體產(chǎn)生的時(shí)間、所能達(dá)到的高度及維持的時(shí)間也存在差別[6]。鴨的高致病性禽流感免疫一般需要2次免疫才能得到較高的免疫抗體[7]。由于肉鴨飼養(yǎng)周期短，45～60 d就出欄，免疫時(shí)機(jī)、劑量選擇顯得尤為重要。本研究表明，試驗(yàn)期間3個(gè)試驗(yàn)組的HI效價(jià)均值均在4 log2以上，0.8 mL組及 1 mL 組的抗體合格率都在70%以上，10 d對肉鴨注射 0.8 mL 疫苗是比較合理的免疫程序。本試驗(yàn)中，禽流感抗體水平一直偏低，鴨群中個(gè)體達(dá)到9 log2或10 log2滴度的很少，一方面可能與鴨對重組禽流感病毒滅活疫苗（H5NI亞型，Re-6 株）敏感性較低有關(guān)，另一方面與水禽血清中可能存在某種非特異性的凝集因子對雞紅細(xì)胞有非特異性凝集作用有關(guān)[8]。禽流感對鴨群危害極大，一旦發(fā)病，會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為提高禽流感疫苗對肉鴨的免疫效果，建議采取以下措施：疫苗的免疫接種要嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，免疫注射時(shí)，要輕逮輕放；提高禽群的免疫力、抗應(yīng)激能力，免疫前后，給禽群的飲水或飼料中添加黃芪多糖、植物血凝素、蜂靈散等免疫促進(jìn)劑促進(jìn)鴨群免疫應(yīng)答，添加適量的電解多維等營養(yǎng)性藥物以提高禽群抗應(yīng)激能力[9]；加強(qiáng)對防疫人員的培訓(xùn)，確保免疫效果、免疫密度。

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