陶 迪 司振陽(yáng) 隆紅艷 張 驃.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江蘇南京 009；.南京市中醫(yī)院兒科，江蘇南京 000；.南京市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 000

黃龍止咳口服液對(duì)咳嗽變異性哮喘模型大鼠白細(xì)胞介素4和γ干擾素的影響

陶 迪1司振陽(yáng)2▲隆紅艷3張 驃2
1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江蘇南京 210029；2.南京市中醫(yī)院兒科，江蘇南京 210001；3.南京市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210001

目的通過(guò)測(cè)定與分析各組大鼠血清及肺泡灌洗液（BALF）中γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（IL-4）含量，觀察黃龍止咳口服液對(duì)咳嗽變異性哮喘（CVA）模型大鼠免疫功能的影響，進(jìn)而探討黃龍止咳口服液調(diào)節(jié)CVA免疫功能紊亂的作用機(jī)制。 方法 利用卵蛋白（OA）和氫氧化鋁共同激發(fā)致敏建立CVA大鼠模型，將大鼠分為正常組、模型組、黃龍高劑量組、黃龍中劑量組、黃龍低劑量組、先聲咳喘寧組、布地奈德組，記錄引喘誘咳時(shí)2 min內(nèi)大鼠咳嗽次數(shù)及血清和支氣管BALF中IL-4、IFN-γ含量。結(jié)果與正常組比較，模型組咳嗽次數(shù)明顯增多（P＜0.01），血清和支氣管BALF中IL-4含量顯著升高（P＜0.01），IFN-γ含量降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組咳嗽次數(shù)均明顯減少（P＜0.01），血清及BALF中IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；黃龍高劑量組與黃龍低、中劑量組比較，咳嗽次數(shù)明顯減少，血清及BALF中IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與先聲咳喘寧組比較，黃龍高劑量組血清IFN-γ值相對(duì)升高，BALF中IL-4值相對(duì)降低，IFN-γ值相對(duì)升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與布地奈德組比較，黃龍高劑量組血清IFN-γ值相對(duì)升高，BALF中IL-4值相對(duì)降低，IFN-γ值相對(duì)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論黃龍止咳口服液通過(guò)降低機(jī)體的IL-4含量、升高IFN-γ含量發(fā)揮治療CVA的作用。

咳嗽變異性哮喘；白細(xì)胞介素-4；γ干擾素；支氣管肺泡灌洗液；黃龍止咳口服液

咳嗽變異性哮喘 （cough variant asthma，CVA）是哮喘的一種潛在形式或特殊類型。現(xiàn)代中醫(yī)文獻(xiàn)根據(jù)發(fā)病特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)將其命名為 “哮咳”、“風(fēng)咳”等。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CVA與典型哮喘的發(fā)病機(jī)制相同，研究表明［1-2］：CVA與多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子共同參與相互作用所致的慢性非特異性炎癥的病理基礎(chǔ)相吻合，其間接表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性。新近研究發(fā)現(xiàn)［3-4］，輔助性T淋巴細(xì)胞亞群（Th細(xì)胞）功能紊亂，可能是支氣管哮喘發(fā)病中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。而Th細(xì)胞根據(jù)所分泌的細(xì)胞因子的不同，可進(jìn)一步分為Th1和Th2兩個(gè)亞型，γ干擾素 （IFN-γ）、白介素4（IL-4）分別是Th1和Th2的細(xì)胞因子。因此，研制具有調(diào)節(jié)IFN-γ/IL-4免疫功能的中藥有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察黃龍止咳口服液對(duì)CVA模型動(dòng)物血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IFN-γ水平的影響，探討CVA發(fā)病機(jī)制和黃龍止咳口服液的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠 （160～200 g）80只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 藥物 黃龍止咳口服液，由炙麻黃、地龍、杏仁、紫蘇子、桑白皮、前胡、旋覆花、蟬蛻組成，購(gòu)自南京市中醫(yī)院藥劑科，用蒸餾水煎至生藥1.5 kg/L，4℃冰箱保存。先聲咳喘寧：江蘇先聲制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z32020967，規(guī)格10 mL/支。吸入用布地奈德混懸液（普米克令舒）：澳大利亞阿斯利康有限公司，批號(hào)3144771，規(guī)格1 mg/2 mL。

1.1.3 試劑 氫氧化鋁干粉：南京市中醫(yī)院藥劑科提供。卵蛋白（OA）：美國(guó)Sigma公司（批號(hào)1001581887）；辣椒素 （純度＞95%）：南京都萊生物技術(shù)有限公司（批號(hào)19404-86-4），取辣椒素30.5 mg，用吐溫-80溶液及無(wú)水乙醇各1 mL溶解，加入生理鹽水并稀釋成1×10-4mol/L溶液；IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒：聯(lián)科生物科技有限公司（批號(hào)：230430312）；IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒：聯(lián)科生物科技有限公司（批號(hào)238030312）。

1.1.4 器材 402AI超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；自動(dòng)洗板機(jī)（Bio-Tek ELX50）；酶標(biāo)分析儀（Bio-Tek Epoch）。

1.2 方法

1.2.1 CVA動(dòng)物模型的建立 采用卵蛋白和氫氧化鋁共同激發(fā)致敏的方法造模。將除正常組10只大鼠外，其余以配制的含卵蛋白1 mg和氫氧化鋁10 mg的生理鹽水1 mL作皮下注射。分別在兩后足跖、腹股溝、腰、背、頸部共取10點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射0.05 mL，同時(shí)腹腔注射0.5 mL，共計(jì)1 mL，第8天重復(fù)1次以加強(qiáng)致敏。從第15天起，將大鼠置于密閉有機(jī)玻璃罩內(nèi)，給予含1%OA溶液的生理鹽水超聲霧化激發(fā)20 min，以激發(fā)哮喘，以大鼠腹肌明顯收縮為陽(yáng)性，直到出現(xiàn)呼吸加深、加快等呼吸道痙攣癥狀，提示造模成功［5］。

1.2.2 分組與給藥 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為7組（正常組、模型組、布地奈德組、先聲咳喘寧組、黃龍高劑量組、黃龍中劑量組、黃龍低劑量組），每組10只。黃龍止咳口服液低、中、高劑量組給藥濃度為0.75、1.5、3.0 kg/L；先聲咳喘寧口服液組4.2 mL/kg灌胃給藥；布地奈德組（0.12 mL/kg）配以等量的生理鹽水霧化吸入給藥；正常組及模型組同步用1 mL/100 g蒸餾水灌胃。大鼠給藥劑量按60 kg成人體表面積換算而來(lái)。連續(xù)給藥14 d，第15天處死動(dòng)物。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) ①咳嗽次數(shù)測(cè)定方法：將每組大鼠放置在密閉箱內(nèi)，記錄2 min內(nèi)霧化吸入濃度為1×10-4mol/L辣椒素溶液后的咳嗽次數(shù)，將給藥2、4、6 d內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測(cè)定。②血清中IL-4、IFN-γ的含量：腹主動(dòng)脈取血4 mL，標(biāo)本由無(wú)菌干燥管收集，靜置1 h后，4℃2000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃以下保存，測(cè)定方法嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書操作。③BALF中IL-4、IFN-γ的含量：左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)，分3次進(jìn)行，分別灌入生理鹽水4、3、3 mL，共計(jì)10 mL。將3次收集的BALF混合均勻，再以1500 r/min離心5 min，取上清液，-20°C保存，測(cè)定方法嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；除正常對(duì)照外，其余各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠咳嗽次數(shù)的測(cè)定結(jié)果比較

用藥后第2、4、6天，與正常組比較，模型組咳嗽次數(shù)明顯增多（P＜0.01），提示造模成功。用藥后第2、4、6天，各治療組咳嗽次數(shù)與模型組比較均明顯減少（P＜0.01），提示各治療組藥物都具有止咳的功效。用藥后第6天，黃龍各劑量組與先聲咳喘寧組、布地奈德組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示治療組藥物之間止咳作用程度相似。黃龍高劑量組與低、中劑量組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），提示黃龍止咳口服液在改善咳嗽癥狀方面呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠血清中IL-4和IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果比較

與正常組比較，模型組血清IL-4值明顯升高，而IFN-γ值明顯降低（P＜0.01），提示IL-4、IFN-γ與CVA的發(fā)病密切相關(guān)；與模型組比較，各治療組的血清IL-4值明顯降低，IFN-γ值明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01），提示各治療組均對(duì)CVA有一定的治療作用；與黃龍高劑量組比較，先聲咳喘寧組IFN-γ值相對(duì)降低（P＜0.01）；布地奈德組IFN-γ值相對(duì)降低（P＜0.05），提示在調(diào)節(jié)血清IFN-γ含量水平，黃龍高劑量組優(yōu)于先聲咳喘寧和布地奈德組；黃龍高劑量組IL-4和IFN-γ含量與其低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示在調(diào)節(jié)血清中顯示一定的量-效關(guān)系。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ含量的檢測(cè)結(jié)果比較

與正常組比較，模型組BALF中IL-4值明顯升高，而IFN-γ值明顯降低（P＜0.01），提示CVA發(fā)病可影響B(tài)ALF中IL-4和IFN-γ的含量；與模型組比較，各治療組BALF中IL-4明顯降低，IFN-γ明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），提示各治療組均能起到一定的治療作用；與黃龍高劑量組比較，先聲咳喘寧組、布地奈德組BALF中IL-4值相對(duì)升高，IFN-γ值相對(duì)降低（P＜0.01），提示黃龍治療組在調(diào)節(jié)BALF中IL-4和IFN-γ含量?jī)?yōu)于其他治療組；黃龍高劑量組與低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），顯示一定的量-效關(guān)系。見(jiàn)表3。

3 討論

本方在中醫(yī)整體觀念、辨證論治原則的指導(dǎo)下，針對(duì)CVA患兒的病機(jī)多為風(fēng)痰痹陰、肺熱氣逆的特點(diǎn)，確定了祛風(fēng)解痙、宣肺化痰、清氣降逆的基本治法，方中炙麻黃有宣肺平喘、祛風(fēng)降氣之功；地龍有清肺平肝、平喘通絡(luò)之功，為清熱解痙、止咳平喘之要藥，兩藥相合宣降并舉、解痙平喘，使肺氣宣達(dá)通暢，則咳自止喘自平，共為君藥。杏仁有宣肺降氣、止咳化痰之功。紫蘇子有利肺平喘、下氣止咳之功。桑白皮有清肺泄熱、止咳平喘之功。前胡有宣肺降氣、降氣化痰之功，四者均為臣藥。旋覆花、蟬蛻為佐使之藥，其中旋覆花有降氣消痰、和中止逆之功，為治療嗆咳之要藥。蟬蛻有清熱宣肺、祛風(fēng)解痙之功，為治療刺激性干咳與痙咳之要藥。諸藥合用，宣降同施，溫潤(rùn)并用，相輔相成，共奏清熱宣肺、祛風(fēng)解痙、順氣化痰、降逆止咳之功，使風(fēng)去熱清、氣順痰消而咳嗽自愈。本課題前期研究結(jié)果表明［6］，黃龍方治療小兒CVA（風(fēng)熱夾痰證）在改善患兒總體療效、主癥、次癥及證候等諸方面均優(yōu)于對(duì)照組，顯示了中醫(yī)藥治療本病的優(yōu)勢(shì)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為［7-8］，CVA其發(fā)病與免疫因素有關(guān)。細(xì)胞免疫方面發(fā)現(xiàn)哮喘的免疫功能實(shí)質(zhì)是Th1/ Th2亞群功能失調(diào)，表現(xiàn)為Th1功能不足，Th2功能亢進(jìn)。研究表明［9］，糾正Th1/Th2功能失衡，可以減輕氣管哮喘的癥狀。IFN-γ在支氣管哮喘中起保護(hù)作用，在Th1細(xì)胞因子中具有促進(jìn)炎性反應(yīng)，較強(qiáng)的抗病毒、抗細(xì)菌感染和抗寄生蟲感染，加強(qiáng)宿主的防御和參與免疫調(diào)節(jié)的作用，其分泌減少與哮喘的發(fā)生關(guān)系密切［10-11］。而Th2主要分泌IL-4等細(xì)胞因子與IgE合成、嗜酸細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活密切相關(guān)，參與CVA變應(yīng)性炎癥的發(fā)生和發(fā)展，被認(rèn)為是Th2轉(zhuǎn)化的必需因子，并抑制Th1細(xì)胞的效應(yīng)功能［12］。

CVA患兒以咳嗽為主要臨床表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠的咳嗽次數(shù)多于正常組（P＜0.01），證實(shí)造模成功。用藥后第2天，各治療組咳嗽次數(shù)與模型組比較均減少 （P＜0.01），說(shuō)明各治療組均有效緩解CVA大鼠的咳嗽癥狀。用藥后第6天，黃龍各劑量組與先聲咳喘寧組、布地奈德組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明治療組藥物之間止咳作用程度相似。黃龍劑量組間比較，高劑量組與低、中劑量組比較有顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明隨著黃龍劑量的增加，止咳效果更加明顯。

對(duì)血清中IL-4、IFN-γ含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：連續(xù)給藥治療14 d后，與模型組比較，各治療組血清IL-4指標(biāo)含量明顯降低、IFN-γ含量升高 （P＜0.01），說(shuō)明IL-4、IFN-γ與CVA的發(fā)病密切相關(guān)。治療方面，黃龍高劑量組與低、中劑量組比較，IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯升高（P＜0.05），說(shuō)明隨著黃龍止咳口服液劑量加大，治療CVA的效果更顯著，黃龍止咳口服液對(duì)CVA治療作用具有量效關(guān)系。與先聲咳喘寧組和布地奈德組比較，黃龍高劑量組血清中IFN-γ含量較高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），而血清中IL-4含量低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明在調(diào)節(jié)血清IFN-γ含量水平，黃龍高劑量組優(yōu)于先聲咳喘寧和布地奈德組，其調(diào)節(jié)血清中IL-4含量水平與先聲咳喘寧和布地奈德相似。療效方面，與正常組比較，先聲咳喘寧組和布地奈德組在調(diào)節(jié)血清IL-4、IFN-γ的含量有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明其一定程度上緩解CVA病情，使其接近正常水平。而黃龍高劑量組與正常組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明其療效優(yōu)于其他對(duì)照組，從而達(dá)到治療CVA的目的。

對(duì)支氣管BALF中IL-4、IFN-γ的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：BALF中IL-4指標(biāo)含量明顯降低、IFN-γ含量升高，說(shuō)明BALF中IL-4、IFN-γ的含量水平與CVA的發(fā)病密切相關(guān)。治療方面，黃龍高劑量組與低、中劑量組比較，IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯升高，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明黃龍止咳口服液對(duì)CVA治療作用具有量效關(guān)系。與布地奈德組比較，黃龍高劑量組BALF中IL-4含量低，有顯著性差異 （P＜0.01），IFN-γ含量高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明在調(diào)節(jié)BALF中IL-4水平優(yōu)于布地奈德組，在調(diào)節(jié)IFN-γ水平與其相似。與先聲咳喘寧組比較，黃龍高劑量組BALF中IL-4含量低，IFN-γ含量高，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明兩者通過(guò)調(diào)節(jié)BALF中IL-4、IFN-γ含量達(dá)到治療CVA的目的水平相似。療效方面，與正常組比較，先聲咳喘寧組和布地奈德組調(diào)節(jié)BALF中IL-4、IFN-γ含量有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明其一定程度上緩解CVA病情，使其接近正常水平。而黃龍高劑量組與正常組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明其療效優(yōu)于其他對(duì)照組，從而達(dá)到治療CVA的目的。

從本實(shí)驗(yàn)可以看出，黃龍止咳口服液可以明顯改善CVA咳嗽癥狀，通過(guò)調(diào)節(jié)血清及BALF中IFN-γ和IL-4含量達(dá)到治療CVA的目的，且療效優(yōu)于其他對(duì)照組。與模型組比較，治療組的血清及BALF中IL-4水平降低、IFN-γ水平升高，可能是通過(guò)降低機(jī)體IL-4水平，升高機(jī)體IFN-γ水平，以調(diào)控Th1向Th2細(xì)胞分化，引起Th1細(xì)胞的減少，從而減輕氣道炎癥，抑制氣道重塑有關(guān)，這可能是黃龍止咳口服液治療CVA的機(jī)制之一。由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)繁多，因此，實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了黃龍止咳口服液可調(diào)節(jié)Th1/ Th2功能失衡，其治療CVA的深層次機(jī)制有待進(jìn)一步開(kāi)展。

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Effect of Huanglong Cough Liquid on interleukin-4 and interferon-γ of cough variant asthma of model rats

TAO Di1SI Zhenyang2▲LONG Hongyan3ZHANG Biao2
1.Graduate School,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province,Nanjing 210029,China; 2.Department of Pediatrics,Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province,Nanjing 210001, China;3.Central Laboratory,Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province,Nanjing 210001, China

ObjectiveBy measuring and analyzing the content of interferon-γ(IFN-γ),interleukin-4(IL-4)of serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF)in rats of all groups,to observe the effect of Huanglong Cough Liquid on immunologic function of cough variant asthma (CVA)of model rats,so as to investigate the mechanism of Huanglong Cough Liquid in adjusting the immune dysfunction of CVA.Methods The egg albumin (OA)and aluminum hydroxide were used to motivate sensitization to establish CVA model of rats,and the rats were divided into normal group,model group,high dose of Huanglong group,medial dose of Huanglong group,low dose of Huanglong group,Xiansheng Kechuanning group,Budesonide group.The cough times and contents of IFN-γ,IL-4 of serum and bronchus BALF at inducing dyspnea with cough whin 2 min were recorded.Results Compared with normal group,the cough times of model group were increased significantly (P＜0.01),the content of IL-4 of serum and bronchus BALF was increased significantly(P＜0.01),the content of IFN-γ was decreased significantly(P＜0.01);compared with model group,the cough times of all groups decreased significantly(P＜0.01),the content of IL-4 of serum and BALF was decreased significantly,the content of IFN-γ was increased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.05 or P＜0.01);compared with low,medial dose of Huanglong group,the cough times of high dose of Huanglong group were decreased significantly,the content ofIL-4 of serum and bronchus BALF was decreased significantly,the content of IFN-γ was increased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.05 or P＜0.01);compared with Xiansheng Kechuanning group,the content of serum IFN-γ of high dose of Huanglong group was increased relatively,the content of IL-4 of BALF was decreased relatively,the content of IFN-γ was increased relatively,the differences were statistically significant(P＜0.01); compared with Budesonide group,the content of serum IFN-γ of high dose of Huanglong group was increased relatively,the content of IL-4 of BALF was decreased relatively,the content of IFN-γ was increased relatively,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Huanglong Cough Liquid play a treatment role in CVA by decreasing the contents of IL-4 and increasing the contents of IFN-γ.

Cough variant asthma;Interleukin 4;Interferon-γ;Bronchoalveolar lavage fluid;Huanglong Cough Liquid

R562.25

A

1673-7210(2015)01(b)-0008-05

2014-09-19本文編輯：張瑜杰）

江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目（編號(hào)LZ13100）。

陶迪（1988-），女，南京中醫(yī)藥大學(xué) 2012級(jí)中醫(yī)兒科學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：小兒肺系疾病。

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