胡政　蘇明杰　焦湞

摘要：使用SDS-PAGE方法結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)，分析了59個(gè)有代表性的河南省小麥主栽品種（系）及部分穩(wěn)定遺傳的誘變后代材料的HMW-GS組成及其等位變異。參試材料中共有12種HMW-GS亞基類型，Glu-A1位點(diǎn)上有3種，其中1亞基為主要類型（占57.63%）；Glu-B1位點(diǎn)上共有4種類型，以7+9為主要亞基類型（占67.80%）；Glu-D1位點(diǎn)上有5種亞基組合，其中2+12為主要類型（占52.54%）。59份小麥材料的亞基組合類型共有19種，其中組合為Null、2+12、7+9的樣品11份（占18.64%），比例最高；在參試材料中，僅有4個(gè)材料檢測(cè)出優(yōu)質(zhì)亞基組合類型（1，7+8，5+10）；此外，從SDS-PAGE電泳圖譜上發(fā)現(xiàn)有16個(gè)材料含有與1Dx5非常近似的亞基（以1Dx5*表示），使用引物Dx*對(duì)上述材料進(jìn)行擴(kuò)增，均可獲得約476 bp的電泳條帶，其序列信息與HMW-Dtx2基因、HMW-Dtx5基因相同，與1Dx5′基因編碼區(qū)相同，與1Dx5基因99%相似。

關(guān)鍵詞：小麥；高分子量麥谷蛋白亞基（HMW-GS）；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；STS分子標(biāo)記；Dx5亞基

中圖分類號(hào)： S512.103.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0024-05

收稿日期：2014-04-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：11375154）；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號(hào)：122300410045）。

作者簡(jiǎn)介：胡政（1988—），男，江西新余人，碩士研究生，主要從事麥類作物遺傳育種研究。E-mail：gyzw@hotmail.com。

通信作者：焦湞，教授，主要從事麥類作物遺傳育種研究。E-mail：gyzw@hotmail.com。近年來優(yōu)質(zhì)成為小麥育種的主攻目標(biāo)之一[1]，在影響小麥加工品質(zhì)的各因素中，高分子量麥谷蛋白亞基（HMW-GS）起著重要作用[2-3]。用于檢測(cè)HMW-GS最簡(jiǎn)單有效的方法就是SDS-PAGE電泳，但對(duì)于部分電泳條帶近似的亞基（如1Bx7和1Bx7OE）僅靠電泳圖譜很難區(qū)分。目前大量編碼 HMW-GS 的基因已被克隆，與其相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)也有很多報(bào)道，而分子標(biāo)記在育種中的應(yīng)用研究也日趨成熟[4]，且有試驗(yàn)證實(shí)，HMW-GS分子標(biāo)記與其SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果高度一致[5]。因此，將SDS-PAGE與分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合應(yīng)用到HMW-GS鑒定工作中，在保持便捷、快速優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，必將大大提高鑒定的準(zhǔn)確性。

小麥Glu-D1位點(diǎn)存在廣泛的等位變異，早在20世紀(jì)90年代Dovidio等就對(duì)硬粒小麥中1Dx2.2+1Dy12、1Dx2.2*+1Dy12、 1Dx2+1Dy12*、 1Dx4+1Dy12等稀有亞基組合進(jìn)行了分子檢測(cè)，并驗(yàn)證了其中x型亞基與1Dx5亞基基因的差異[6-7]。近期也不斷有新的Glu-D1位點(diǎn)x型亞基被發(fā)現(xiàn)。隨著與節(jié)節(jié)麥的雜交，1Dx5+1Dy12、1Dx2.1+1Dy10、1Dx2+1Dy12.2、1Dx2.1+1Dy12.2、1Dx1.5+1Dy10、1Dx2.1+1Dy10.5以及1Dx1.5+1Dy12等亞基組合也不斷被引入小麥[8]。

小麥?zhǔn)呛幽鲜≈匾募Z食作物，對(duì)小麥高分子量麥谷蛋白亞基的研究多數(shù)還停留在20個(gè)基礎(chǔ)分型上，關(guān)于主要的栽培品種和常用的親本材料是否含有特殊亞基組合鮮有報(bào)道。為了進(jìn)一步了解河南省育種工作者常用種質(zhì)資源的品質(zhì)性狀，本試驗(yàn)使用SDS-PAGE方法結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)，分析了59個(gè)有代表性的河南省小麥主栽品種（系）及部分穩(wěn)定遺傳的誘變后代材料的HMW-GS組成及其Glu-D1位點(diǎn)亞基等位變異，從中發(fā)掘新的亞基，并為這些材料的進(jìn)一步利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

選用材料共59份，其中33份為河南省主栽品種及育種工作者經(jīng)常使用的親本材料（由鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所馬香花研究員惠贈(zèng)），26份為筆者實(shí)驗(yàn)室保存的使用離子束誘變技術(shù)輻照小麥后篩選出的后代穩(wěn)定的突變體材料（編號(hào)為鄭大****，“*”表示數(shù)字），HMW-GS對(duì)照材料（表1）由中國科學(xué)院遺傳研究所李義文研究員惠贈(zèng)。

1.2材料蛋白質(zhì)樣品提取

本研究方法根據(jù)曹俊梅等的方法[12]改進(jìn)。

1.3DNA樣品提取

使用CTAB法提取小麥幼苗中的DNA[16-17]。

1.4HMW-GS 電泳

采用不連續(xù)分離系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE電泳。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度5%。1×甘氨酸電極緩沖液配方為 0.025 mol/L Tris，0.19 mol/L甘氨酸，0.1% SDS。使用 DYCZ-24DN 型垂直電泳槽（北京六一儀器廠），恒壓120 V，電泳4 h。染色液：45%甲醇，10%冰乙酸，0.15%考馬斯亮藍(lán)G250。染色2 h，用蒸餾水脫色。使用數(shù)碼相機(jī)拍照，并用camera RAW軟件后期調(diào)節(jié)曝光度、對(duì)比度等。參照Payne 等的亞基命名及編號(hào)的方法[18]對(duì)亞基進(jìn)行記錄。

1.5分子標(biāo)記檢測(cè)

1.6數(shù)據(jù)分析

HMW-GS參照Payne等的方法[18，20]進(jìn)行編號(hào)以及品質(zhì)評(píng)分。

2結(jié)果與分析

2.1供試小麥材料的HMW-GS 等位變異

以對(duì)照材料（表1）SDS-PAGE電泳譜帶為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)59 份小麥材料的HMW-GS進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，59份供試材料中共檢測(cè)到12 種HMW-GS 類型。Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點(diǎn)上的等位變異分別為3、4、5種。Glu-A1位點(diǎn)的3種等位變異中1亞基比例最大，達(dá)到59.32%。Glu-B1位點(diǎn)上的4種等位變異中，7+9亞基出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)到6780%。Glu-D1位點(diǎn)是3個(gè)位點(diǎn)中等位亞基組合變異最為豐富的，且 2+12 亞基出現(xiàn)頻率最高，為50.85%。此外，有2份材料同時(shí)含有1Dx2、1Dx5*亞基。表259 個(gè)小麥材料的HMW-GS組成

品種

2.2供試小麥材料HMW-GS的組合類型

由表3、表4可知，59份小麥材料中，Glu-1位點(diǎn)共檢測(cè)到19種亞基組合，類型較多。其中null/7+9/2+12組合的材料有11份，出現(xiàn)頻率為18.64%；其次是1/7+9/2+12組合，出現(xiàn)頻率為16.95%；其余亞基組合出現(xiàn)的頻率都低于10%。由于某些亞基的品質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)尚未確定，20種亞基組合中只有6種得到評(píng)分結(jié)果，評(píng)分值介于5～10分之間。1/7+8/5+10亞基組合的評(píng)分值最高，但其頻率僅有678%；相反，null/7+9/2+12組合出現(xiàn)的頻率最高，但其評(píng)分值僅為5分。

2.3使用分子標(biāo)記鑒定 Dx5近似亞基Dx5*

通過SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，有16個(gè)材料[鄭大0601、L799、鄭大0605、周麥28、周麥27、鄭大0741、鄭大0942、鄭大0643、鄭大0747、中國農(nóng)大9D483s2199、偃展99（98）、溫6、鄭麥883、偃展988-3-2、鄭大0912、鄭大0817]Glu-D1x型HMW-GS的電泳速率都快于1Dx5亞基（部分材料的電泳圖譜見圖1），而且與其連鎖的Glu-D1位點(diǎn)y型HMW-GS也并非1Dy10亞基，而是1Dy12亞基。

使用Dx5分子標(biāo)記引物對(duì)上述16份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)均表現(xiàn)為陰性（部分材料分子標(biāo)記擴(kuò)增圖譜見圖2）。根據(jù)NCBI已有 Glu-D1位點(diǎn)x型亞基的序列多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物Dx*再次對(duì)以上材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可獲得約476 bp的電泳條帶。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收測(cè)序并進(jìn)行BLAST分析發(fā)現(xiàn)（圖3），其序列信息與Aegilops tauschii HMW-Dtx2等位基因[21]、Triticum aestivum 株系SQ-884、SQ-188、SQ-783、SQ-180、SQ-659高分子量麥谷蛋白亞基Dtx5等位基因[22]相似程度為100%，與小麥1Dx5亞基對(duì)應(yīng)基因相似程度為99%，與1Dx5′ 編碼區(qū)[23]相似度100%。

3結(jié)論與討論

許多研究證明，在育種早代選擇中，根據(jù)HMW-GS與品質(zhì)相關(guān)性的大小，選擇與優(yōu)質(zhì)有關(guān)的亞基作為優(yōu)良的標(biāo)志和育種目標(biāo)是可行的[24-28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，檢測(cè)的59份小麥材料HMW-GS 的變異和組合類型均比較豐富，在Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點(diǎn)上共檢測(cè)到12種亞基和20 種亞基組成，其中有35個(gè)含有1亞基，3個(gè)含2*亞基，13個(gè)含7+8亞基，5個(gè)含14+15亞基，7個(gè)含5+10亞基，這些材料可供優(yōu)質(zhì)小麥育種利用。與前人研究結(jié)果相比，參試的59份材料在Glu-A1位點(diǎn)編碼的與優(yōu)質(zhì)有關(guān)的1Ax1和1Ax2*亞基的比率（64.41%）高于國內(nèi)育成品種（10.78%～42.6%）平均水平，Glu-B1位點(diǎn)上的7+8優(yōu)質(zhì)亞基（22.03%） 在國內(nèi)育成品種（36.1%～65.96%）中屬于較低水平，在Glu-D1位點(diǎn)上5+10亞基比例（11.86%）在國內(nèi)育成品種（9.30%～3636%）中屬于較低水平， 表明河南省小麥育種比較重視品

質(zhì)的改良，擁有一批性狀優(yōu)良、品質(zhì)較優(yōu)的資源[12，29-33]。但在這些資源中，優(yōu)質(zhì)亞基組合類型較少，“1Ax1、Bx7+By8、1Dx5+1Dy10”評(píng)分最高的組合所占比率僅為6.78%，因此在河南省小麥品質(zhì)育種中，應(yīng)注重利用含有不同位點(diǎn)優(yōu)質(zhì)亞基的親本材料配制雜交組合，使不同的優(yōu)質(zhì)亞基能充分聚合到同一材料中，從而選育出優(yōu)質(zhì)亞基聚合體，改良小麥的亞基組成，提高小麥品質(zhì)。

SDS-PAGE電泳技術(shù)是分析鑒定小麥HMW-GS最簡(jiǎn)單快速的方法。但是如果得到的電泳譜帶與對(duì)照樣品有細(xì)小差異、難以判定時(shí)，使用分子標(biāo)記技術(shù)輔助鑒定最為有效、快捷。本研究利用這一方法成功區(qū)分1Dx5*亞基，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)其序列信息與小麥近似種的HMW-Dtx2等位基因一致，這在以往對(duì)河南省小麥材料的研究中未見報(bào)道。以往認(rèn)為小麥HMW-GS高度保守，然而近期Glu-D1d位點(diǎn)不斷有新的等位基因被發(fā)現(xiàn)[8，21-23]。最近有報(bào)道推測(cè)，10 000年前，小麥Glu-D1d位點(diǎn)起源自不同的供體，因此小麥Glu-D1d位點(diǎn)還是存在著不同的等位基因變異[34]。本研究分析的河南省目前廣泛使用的部分小麥材料中大量存在著與1Dx5亞基SDS-PAGE電泳譜帶相似，過去被認(rèn)為是1Dx5亞基（如溫6）的儲(chǔ)藏蛋白，這類亞基的品質(zhì)特性尚未得到鑒定。對(duì)它的鑒定與品質(zhì)研究或許可以為今后的小麥品質(zhì)育種工作作出一定貢獻(xiàn)。

在對(duì)NCBI已登記的所有Glu-D1位點(diǎn)x型亞基DNA序列進(jìn)行比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)第353位僅存在G（同1Dx5亞基）、C（同1Dx2亞基）2種變異。使用中國春全基因組為模板，Dx*引物也可通過錯(cuò)配擴(kuò)增得到約476 bp條帶；而使用純水作為對(duì)照，Dx*引物無法得到擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，在使用分子標(biāo)輔助鑒定小麥1Dx5亞基時(shí)，本研究使用的Dx*引物可以作為Dx5分子標(biāo)記的對(duì)照使用，在Dx5分子標(biāo)記擴(kuò)增條帶為null時(shí)，使用Dx*引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，如果可以得到約476 bp條帶，則可斷定樣品Dx5分子標(biāo)記擴(kuò)增為陰性。通過這個(gè)方法可以排除Dx5分子標(biāo)記PCR檢測(cè)中可能出現(xiàn)的假陰性，從而提高分子標(biāo)記輔助鑒定1Dx5亞基的準(zhǔn)確性。

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