付玉嬌，胡元晶(天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070；天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院)

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高危型人乳頭瘤病毒陽性的宮頸癌組織中L1基因甲基化水平變化及意義

付玉嬌1，胡元晶2(1天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070；2天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院)

摘要：目的觀察持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)陽性的宮頸癌組織中長散布核元件-1(L1)基因甲基化水平變化，并探討其意義。方法收集HR-HPV均陽性的正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN) I組織、CINⅡ～Ⅲ組織及宮頸癌組織各30份。采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合焦磷酸測序技術(shù)對所有組織DNA的 L1序列3 個CpG 位點進行甲基化定量檢測，評價其對子宮頸癌和CIN的診斷價值。結(jié)果正常宮頸組織、CIN Ⅰ組織、CINⅡ～Ⅲ組織及宮頸癌組織中L1基因平均甲基化水平分別為0.590±0.053、0.570±0.038、0.560±0.025、0.490±0.054，宮頸癌組織中L1基因平均甲基化水平與其他組織中比較，P均<0.001。選取L1基因啟動子區(qū)甲基化水平的截斷值為53.17%，此時其判斷宮頸病變性質(zhì)的靈敏度及特異度均為86.70%。95%置信區(qū)間(CI)為0.834～0.976。結(jié)論 HR-HPV陽性的宮頸癌組織中L1基因甲基化水平明顯降低。L1基因啟動子區(qū)甲基化水平為53.17%時，有助于宮頸病變性質(zhì)的判斷。

關(guān)鍵詞：子宮腫瘤；宮頸癌；長散布核元件-1；DNA甲基化

宮頸癌近年來在中國的發(fā)病率及病死率呈明顯上升趨勢[1]。持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是導致宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌的主要原因[2]。宮頸脫落細胞學聯(lián)合HR-HPV的檢測是目前宮頸癌篩查的重要手段，但仍存在漏診[3]。因此，需要有新的標志物來作為宮頸病變篩查、診斷等的有效手段?；蚣谆诒姸嗄[瘤的發(fā)生中具有重要意義，是表觀遺傳學的一種常見過程。有研究[4]發(fā)現(xiàn),基因甲基化在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程起重要作用。長散布核元-1(L1)拷貝數(shù)>50萬，約占全基因組的17%，L1基因甲基化水平與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關(guān)[5]。本研究對HR-HPV陽性宮頸病變組織中L1基因啟動子區(qū)的甲基化水平進行了檢測，并探討其意義。

1資料與方法

1.1臨床資料收集2014年5～10 月在天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科門診就診首次陰道鏡活檢發(fā)現(xiàn)宮頸異常,同時經(jīng)第2 代雜交捕獲(HC-Ⅱ)證實HR-HPV陽性患者。共納入120 例研究對象，年齡22～65(43.05±10.59)歲。其中正常宮頸(正常組)、CINⅠ(CINⅠ組)、CINⅡ～Ⅲ(CINⅡ～Ⅲ組)、宮頸鱗癌(宮頸癌組)組織各30份。所有組織經(jīng)病理組織學檢查證實。每份約50 mg 組織，放入液氮中保存以備提取基因組DNA。

1.2主要試劑及儀器基因組DNA 亞硫酸鹽處理試劑盒(Zymo Research)； DreamTaqTM Green Master Mix(Fermentas)； 焦磷酸測序試劑(QIAGEN)； Universal 32R低溫離心機(Hettieh)；紫外可見光分光光度計NanoDrop 2000(Thermo)；PCR擴增儀(ABI)； PyroMarkQ96 ID 焦磷酸測序儀(QIAGEN)；所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1DNA提取及化學修飾采用酚—氯仿抽提法提取宮頸組織DNA。提取后使用紫外可見光分光光度計測定DNA A260/A280值在1.7 ～2.0為合格樣品，并計算DNA含量，-80 ℃保存?zhèn)溆?。DNA 亞硫酸鹽修飾:取500 ng DNA，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit TM說明書對基因組DNA進行甲基化修飾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2DNA體外擴增對組織DNA的L1基因啟動子甲基化區(qū)域進行PCR擴增。50 μL的PCR擴增體系中包括Mix 25 μL，無核酶水22 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA(30 ng/μL)1 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃、5 min,95 ℃、30 s,50 ℃、30 s,72 ℃、30 s，50次循環(huán);72 ℃、5 min。將PCR產(chǎn)物行2 %瓊脂糖凝膠電泳,在146 bp位置得到單一條帶，即可進行焦磷酸測序。以雙蒸水代替模板作為空白對照。L1基因的特異性PCR引物及焦磷酸測序引物序列均參考文獻[6]。L1基因上游引物5′-TTTTGAGTTAGGTGTGGGATATA-3′,下游引物:生物素標記的5′-AAAATCAAAAAATTCCCTTTC-3′；焦磷酸測序引物：5′-AGTTAGGTGTGGGATATAGT-3′。

1.3.3L1基因啟動子區(qū)甲基化檢測采用焦磷酸測序法。取35 μL PCR擴增產(chǎn)物至PSQ 96 Plate Low 樣品制備板中，加入30 μL 結(jié)合緩沖液和4 μL 包被有鏈親和素的磁珠，42 ℃震蕩孵育15 min。將探針置入96 孔板上的PCR產(chǎn)物中捕獲帶有雙鏈DNA 產(chǎn)物的磁珠，依次經(jīng)70%乙醇、變性溶液及洗滌液處理5～10 s后制備成單鏈DNA，并將其釋放入已準備好的測序反應體系中。反應體系40 μL，包括退火緩沖液38.8 μL，10 μmol/L測序引物1.2 μL。80 ℃溫育2 min，降至室溫后上機進行焦磷酸測序，通過Pyro Q-CpG 1.0.9軟件獲得L1基因啟動子區(qū)3個位點的甲基化水平定量分析數(shù)據(jù)[7]。

1.3.4判斷宮頸病變性質(zhì)的L1基因啟動子區(qū)甲基化截斷值的確定根據(jù)L1 在不同病變組織中的甲基化水平，描繪ROC曲線，計算曲線下面積(AUC)，選取合適的截斷值用于區(qū)分宮頸病變性質(zhì)。

2結(jié)果

2.1L1基因啟動子區(qū)甲基化檢測結(jié)果擴增的片段位于L1基因啟動子區(qū)211～356 bp(Genebank Accesion number: X58075)處,可檢測到3個CpG 位點。宮頸癌組在檢測的3個CpG位點及3個CpG位點平均甲基化水平(CpG-M)均明顯低于其他組(P<0.001)，正常組、CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組間的甲基化水平比較差異無統(tǒng)計學意義，詳見表1。

±s)

注：與宮頸癌組相比，﹡P<0.001。

2.2判斷宮頸病變性質(zhì)的L1基因啟動子區(qū)甲基化截斷值根據(jù)ROC曲線，計算的AUC為0.905，為減少臨床漏診率，選取L1的截斷值為53.17%，此時其靈敏度及特異度均為86.70%。95%可信區(qū)間(CI)為0.834～0.976。

3討論

DNA甲基化在調(diào)控基因表達及染色體結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多種基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)生甲基化修飾，且這種表觀遺傳學改變與宮頸病變程度有一定相關(guān)性。研究者用基因特異位點甲基化研究方法研究宮頸脫落細胞、血漿標本和宮頸活檢組織等，提出DNA甲基化可用于宮頸癌篩查[8,9]。我們既往研究[10]發(fā)現(xiàn)，HPV16基因長控制區(qū)和抑癌基因E2結(jié)合區(qū)域L1片段3′端甲基化水平與其致病性有關(guān)。

人類染色體中心體周圍的異染色質(zhì)緊密封裝著大量DNA重復序列，其中L1是人類基因組中最豐富的能自主轉(zhuǎn)座的非末端重復序列反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。為減少轉(zhuǎn)錄“噪音”，提高轉(zhuǎn)錄效率，在正常細胞中，異染色質(zhì)處于高度甲基化的表觀遺傳學上的沉默狀態(tài)。但在腫瘤中，基因組的低甲基化往往伴隨著DNA重復序列的低甲基化。L1序列的低甲基化現(xiàn)象已在多種腫瘤中被證實，包括頭頸部惡性腫瘤[11]、膀胱上皮癌[12]、胃癌[13]、結(jié)直腸癌[14]等。目前，L1甲基化狀態(tài)已成為腫瘤基因組整體甲基化水平的標記物[15]。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組在檢測的3個CpG位點及其CpG-M甲基化程度均明顯低于其他組，表明L1基因低甲基化水平與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān),宮頸癌和其他腫瘤一樣,也存在整體基因組甲基化水平降低的現(xiàn)象,這為宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究提供了新的表觀遺傳學思路。研究[16]報道，CpG位點甲基化水平的降低易導致染色體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，是L1 激活后轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)座的主要原因,這種激活與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。

焦磷酸測序技術(shù)能快速檢測甲基化的頻率, 對樣品中的甲基化位點進行定位及定量檢測。通過焦磷酸測序技術(shù)定量檢測L1在不同宮頸組織中的甲基化程度，繪制ROC曲線，得出AUC 為0.905，表明該方法診斷價值較高。參考ROC曲線，并考慮盡可能減少漏診率，選定截斷值為53.17%，判斷良惡性宮頸病變的靈敏度及特異度均為86.70%，這一結(jié)果表明，L1基因甲基化水平對預測和早期診斷宮頸癌具有重要意義。

綜上所述，L1基因低甲基化水平與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)。在后續(xù)工作中我們將進一步檢測宮頸病變中抑癌基因甲基化水平，研究其與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及預后的關(guān)系。

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The methylation level changes of the L1 gene in high-risk human papillomavirus

positive cervical cancer tissue and its significance

FUYu-jiao1， HU Yuan-jing

(1TianjinMedicalUniversityGraduateSchool,Tianjin300070，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of methylation level of the long interspersed nucleotid element-1(L1)in persistent high-risk human papillomavirus (HR-HPV) positive cervical cancer tissue and its significance．MethodsThirty tissue samples were collected in all HR-HPV infected normal cervix, cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ, CINⅡ-CINⅢ and cervical cancer respectively. Three CpG sites methylation levels of the L1 of all tissues were quantitatively analyzed by bisulphite conversion and pyrosequencing technology． Evaluated its diagnostic value in cervical cancer and CIN. ResultsThe mean levels and standard deviation of the L1 promoter methylation level of normal cervix tissue, CINⅠtissue, CINⅡ～Ⅲ tissue and cervical cancer tissue were 0.59±0.053, 0.57±0.038, 0.56±0.025, 0.49±0.054 respectively. Compared the L1 promoter mean methylation level of cervical cancer tissues with other tissues, allP<0.001. Selected the cutoff value of the L1 gene methylation level as 53.17%, both the sensitivity and specificity to judge the property of cervical lesions were 86.70%, with the 95% confidence interval (CI) was 0.834～0.976. ConclusionsThe L1 gene methylation level of HR-HPV positive cervical cancer tissue decrease significantly. It helps to judge the property of cervical lesions with the L1 gene promoter methylation level of 53.17%.

Key words:cervical lesions; cervical cancer; long interspersed nucleotid element-1; DNA methylation

(收稿日期：2014-11-07)

通信作者簡介：胡元晶(1971-)，女，博士，主任醫(yī)師，研究方向為婦科腫瘤。E-mail:tdjhyj@hotmail.com

作者簡介：第一付玉嬌(1987-)，女，在讀研究生，研究方向為婦科腫瘤。E-mail:fuyujiao2012@163.com

基金項目：天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目(13KG134)。

中圖分類號：R737.33

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)03-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.003