楊成萬(wàn)，陶明珠，龍漢安(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

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直腸黏液腺癌組織中四種耐藥基因蛋白的表達(dá)變化及意義

楊成萬(wàn)，陶明珠，龍漢安(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

摘要：目的觀察直腸黏液腺癌(MUC)組織中多藥耐藥基因p-糖蛋白(p-gp)、胸苷酸合酶(TS)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(TopoⅡ)的表達(dá)變化，并探討其意義。方法應(yīng)用免疫組化SP法對(duì)37例直腸黏液腺癌及261例直腸非黏液腺癌(non-MUC)組織中p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與MUC臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果直腸黏液腺癌與非黏液腺癌組織中p-gp陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.1%、94.5%，TS陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.8%、72.0%，GST-π陽(yáng)性表達(dá)率分別為51.4%、73.9%，TopoⅡ陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.2%、71.6%，直腸黏液腺癌與非黏液腺癌組織中p-gp、GST-π陽(yáng)性表達(dá)率比較，P均<0.01。GST-π與直腸黏液腺癌分化程度有關(guān)，高中分化者GST-π陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低分化者(P<0.01)，p-gp、TS、TopoⅡ表達(dá)與直腸黏液腺癌臨床病理參數(shù)間無(wú)相關(guān)性。p-gp與TS表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.349，P<0.05)。結(jié)論直腸黏液腺癌組織中TS表達(dá)升高，p-gp、GST-π、TopoⅡ表達(dá)降低，GST-π表達(dá)與直腸黏液腺癌分化程度有關(guān)；四種耐藥基因蛋白聯(lián)合檢測(cè)可為直腸黏液腺癌化療藥物的篩選及個(gè)體化治療方案制定提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：直腸腫瘤；黏液腺癌；p-糖蛋白；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶；DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶；胸苷酸合酶；多藥耐藥

大腸黏液腺癌是大腸癌的一種特殊類(lèi)型，占大腸癌患者的1.6%～25.4%[1，2]，主要治療手段是手術(shù)切除結(jié)合化療的綜合治療模式。直腸黏液腺癌可切除率低，易對(duì)化療藥物耐藥，治療效果不佳。明確相關(guān)耐藥基因產(chǎn)物在直腸黏液腺癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)對(duì)了解直腸黏液腺癌的生物學(xué)特性、指導(dǎo)患者個(gè)性化治療有重要意義[3]。本研究觀察了直腸黏液腺癌組織中耐藥基因蛋白p-糖蛋白(p-gp)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo Ⅱ)、胸苷酸合酶(TS)表達(dá)變化，并探討其意義?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料2010年1月～2013年10月就診于瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的直腸癌患者298例，男179例、女119例，平均年齡62.35歲。術(shù)前均未行放療、化療等治療。依據(jù)WHO黏液腺癌的判定標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行分類(lèi)，黏液腺癌(黏液樣物質(zhì)占腫瘤體積的50.0%以上)37例，非黏液腺癌261例。298例均經(jīng)手術(shù)治療并留取腫瘤組織。

1.2p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ檢測(cè)方法所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，采用免疫組化SP法進(jìn)行染色。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照，以各自已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。p-gp陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，TS和 GST-π陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，TopoⅡ陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核。相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒即判為陽(yáng)性表達(dá)。p-gp、TS和GST-π陽(yáng)性強(qiáng)度以+表示，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10%～25%為(+)，26%～75%為(++)，≥75%為(+++)。TopoⅡ陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)以級(jí)別表示，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%為Ⅰ級(jí)，26%～50%為Ⅱ級(jí)，51%～75%為Ⅲ級(jí)，>75%為Ⅳ級(jí)。(-)和(+)或Ⅰ級(jí)視為陰性，≥(++)或Ⅱ級(jí)視為陽(yáng)性，p-gp、TS、GST-π≥(++)、TopoⅡ≤Ⅰ級(jí)具有診斷意義，表明腫瘤具有多藥耐藥性[5，6]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)分析法對(duì)p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

直腸黏液腺癌與非黏液腺癌組織中p-gp陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.1%、94.5%，TS陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.8%、72%，GST-π陽(yáng)性表達(dá)率分別為51.4%、73.9%，Topo Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.2%、71.6%，直腸黏液腺癌與非黏液腺癌組織中p-gp、GST-π陽(yáng)性表達(dá)率比較，P均<0.01。GST-π與直腸黏液腺癌分化程度有關(guān)，高中分化者GST-π陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低分化者(P<0.01)；p-gp、TS、Topo Ⅱ在直腸黏液腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05),見(jiàn)表1。p-gp與TS呈正相關(guān)(r=0.349，P<0.05)，而其余指標(biāo)間無(wú)明顯相關(guān)性。

表1　p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白表達(dá)與直腸黏液腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3討論

黏液腺癌是直腸癌的特殊類(lèi)型，可切除率低，選擇敏感的化療藥物對(duì)術(shù)后化療有重要意義。腫瘤多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因。目前已發(fā)現(xiàn)，p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ在多種腫瘤耐藥性上發(fā)揮重要作用，但對(duì)直腸黏液腺癌同時(shí)檢測(cè)上述4種蛋白表達(dá)及其意義的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

p-gp是由7號(hào)染色體上的多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的跨膜糖蛋白，為一種ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)泵，其跨膜結(jié)構(gòu)具有能量依賴性“藥物泵”功能，能將細(xì)胞內(nèi)帶陽(yáng)性電荷的親脂類(lèi)化療藥物逆濃度泵至細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物達(dá)不到有效作用濃度從而產(chǎn)生耐藥性[7]。因而p-gp的表達(dá)水平與耐藥程度呈正比。其所介導(dǎo)的抗癌藥物主要為植物堿類(lèi)、阿霉素、紫杉醇和泰素帝等。本研究直腸黏液腺癌組織中p-gp陽(yáng)性表達(dá)率率為81.1%,明顯低于非黏液腺癌，說(shuō)明直腸黏液腺癌對(duì)植物堿類(lèi)、阿霉素等藥物化療較非黏液腺癌相對(duì)敏感。直腸黏液腺癌p-gp表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明直腸黏液腺癌在p-gp介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制上不同于其他大腸癌。

GST是一組具有解毒和結(jié)合蛋白質(zhì)功能的同工酶，與多藥耐藥相關(guān)的有GST-α、GST-μ和GST-π。其中GST-π是腫瘤細(xì)胞和組織中最常見(jiàn)且與腫瘤耐藥關(guān)系最密切的一種亞型，其能催化親電子物質(zhì)與GST結(jié)合，并與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合增加其水溶性，促進(jìn)藥物代謝，從而降低抗癌藥物的細(xì)胞毒作用。其過(guò)度表達(dá)與順鉑、氮芥、環(huán)磷酰胺、瘤可寧和阿霉素耐藥有關(guān)。本研究直腸黏液腺癌組織中GST-π陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于直腸非黏液腺癌，說(shuō)明直腸黏液腺癌對(duì)順鉑、氮芥等化療藥物較非黏液腺癌相對(duì)敏感，GST-π陽(yáng)性表達(dá)與黏液腺癌分化程度呈正相關(guān)。

TS是胸苷酸合成的限速酶，其功能是催化尿嘧啶脫氧核苷(dUMP)甲基化為胸腺嘧啶脫氧核苷(dTMP)，此步驟為DNA生物合成所必須，故TS被抑制，將抑制DNA合成進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。研究表明TS與腫瘤細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性呈明顯負(fù)相關(guān)，當(dāng)TS過(guò)度表達(dá)時(shí)，不能徹底阻斷TS，將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥，低表達(dá)的TS預(yù)示著腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU較好的敏感性[8，9]。本研究顯示，直腸黏液腺癌TS陽(yáng)性表達(dá)率與非黏液腺癌無(wú)顯著性差異，均對(duì)5-FU有較高的耐藥性，進(jìn)行TS檢測(cè)將有助于確定是否選用5-FU化療。TS表達(dá)與p-gp呈明顯正相關(guān)，提示二者在直腸黏液腺癌的多藥耐藥發(fā)生機(jī)制中可能發(fā)揮某種協(xié)同作用。

TopoⅡ是DNA復(fù)制必需的酶，催化單鏈或是雙鏈DNA斷裂，促進(jìn)DNA復(fù)制。當(dāng)基因發(fā)生突變時(shí)，抗癌藥物不能與其結(jié)合，產(chǎn)生細(xì)胞耐藥。以TopoⅡ?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物主要為蒽環(huán)類(lèi)抗生素和鬼臼霉素類(lèi)如VP16、替尼泊苷、玫瑰樹(shù)堿、新霉素和阿霉素等。本研究結(jié)果顯示，直腸黏液腺癌TopoⅡ陽(yáng)性率與非黏液腺癌無(wú)明顯差異，且與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等無(wú)明顯關(guān)系。與王恒樹(shù)等[10]對(duì)大腸癌的研究結(jié)果不同，后者發(fā)現(xiàn)大腸癌TopoⅡ表達(dá)與分化程度、臨床分期呈正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明直腸黏液腺癌在TopoⅡ介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制上不同于其他大腸癌。

本研究結(jié)果顯示，p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ在直腸黏液腺癌組織中均有表達(dá)，且直腸黏液腺癌組織中p-gp、GST-π陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于非黏液腺癌，而GST-π與直腸黏液腺癌分化程度有關(guān)，高中分化者GST-π陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低分化者。本組直腸黏液腺癌p-gp與TS共表達(dá)率高達(dá)73.0%，而相關(guān)分析結(jié)果顯示p-gp與TS呈正相關(guān)，提示二者可能存在相互調(diào)節(jié)機(jī)制?？梢?jiàn)直腸黏液腺癌多藥耐藥機(jī)制是多基因、多途徑共同參與的結(jié)果，聯(lián)合檢測(cè)p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ可為直腸黏液腺癌化療藥物的篩選及個(gè)體化治療方案制定提供重要依據(jù)。

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Significance of expression of 4 drug resistant gene proteins p-gp, TS, GST-π

and TopoⅡin mucousadenocarcinoma of the rectum

YANGCheng-wan，TAOMing-zhu，LONGHan-an

(TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the change of expression of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡ in mucousadenocarcinoma(MUC) of the rectum, and investigate its significance. Methods The expression of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡ in 37 cases of MUC and 261 cases of non- mucousadenocarcinoma (non-MUC) of the rectum was detected by using immunohistochemical SP method．ResultsThe positive expression rate of p-gp in MUC and non-MUC was 81.1% and 94.5%，respectively. The positive rate of TS was 83.8% and 72.0%, the positive rate of GST-π was 51.4% and 73.9%, and the positive rate of TopoⅡwas 62.2% and 71.6%. The positive expression rate of p-gp and GST-π in MUC was significantly lower than that in non-MUC (P<0.01). The expression of GST-π was correlated with tumor degree of differentiation, and the positive rate of GST-π in well or moderately differentiated MUC was significantly higher than that in poorly differentiated MUC (P<0.01). The expression of p-gp, TS and TopoⅡ was not correlated with clinical and pathological features of MUC. P-gp expression was positively correlated to TS expression (P<0.05). ConclusionThe expression of TS is heightened and the expression of p-gp, GST-π and TopoⅡ is degraded in MUC of the rectum. The expression of GST-π is correlated with tumor degree of differentiation．The joint detection of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡwill be useful for choosing sensitive chemotherapeutic drugs and selecting individual therapeutic regimen in rectum MUC treatment.

Key words:rectum； mucousadenocarcinoma； p- glycoprotein； Thymidylate synthase； glutathione transferase-π；topoisomeraseⅡ； multidrug resistance

(收稿日期：2014-10-11)

通信作者簡(jiǎn)介：龍漢安(1964-)，男，碩士，教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤病理。Email：longhanan@qq.com

作者簡(jiǎn)介：第一楊成萬(wàn)(1969-)，男，碩士，副教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤病理。E-mail:ycwty@163.com

基金項(xiàng)目：四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(14JC0039)。

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.37

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)03-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.002