劉 偉，傅秋玲，黃 瑜，傅光華，陳 珍，陳紅梅，程龍飛，萬(wàn)春和，施少華，林建生

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002 ；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州350013）

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）感染雛鴨引起的一種傳播迅速的高度致死性傳染病，以角弓反張和肝臟腫大、出血為主要臨床特征。最初將DHV 分為3 個(gè)血清型，分別是1 型、2 型、3 型鴨肝炎病毒（DHV），但最新研究表明，傳統(tǒng)的血清2型和3 型均屬星狀病毒[1]，不宜將它們稱為DHV的2 個(gè)血清型。根據(jù)2008 年后的分類，將引起鴨甲型病毒性肝炎的病毒歸屬于小RNA 病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，稱為鴨甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）。目前發(fā)現(xiàn)，DHAV 包含3 種基因型(或血清型)，分別命名為DHAV-1、2 型和3 型[2]，其中DHAV-1 型即為傳統(tǒng)的血清1 型鴨肝炎病毒[3]，DHAV-2 型和DHAV-3型分別為近來(lái)報(bào)道的臺(tái)灣新型[4]和韓國(guó)新型[5]。

2011 年，我國(guó)福建、浙江、廣東等省的部分養(yǎng)鴨場(chǎng)10～30 日齡雛番鴨、半番鴨發(fā)生以胰腺泛黃、出血（俗稱胰腺炎）為特征的疫病，其發(fā)病率和病死率分別達(dá)10%～30%、25%～40%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室的病原學(xué)研究確定其病原為鴨1 型甲肝病毒（DHAV-1）[6-7]，但其在易感宿主、組織嗜性和特征肉眼病變上均不同于經(jīng)典的肝炎型鴨1 型甲肝病毒。為區(qū)別起見(jiàn)，將其暫定為胰腺炎型DHAV-1。我們經(jīng)血清交叉中和試驗(yàn)等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胰腺炎型DHAV-1 與肝炎型DHAV-1 間的抗原相關(guān)值（R）為0.62，表明胰腺炎型DHAV-1 與經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 相比其抗原性發(fā)生了較大變異，定名為鴨1 型甲肝病毒亞型（DHAV-1a）（見(jiàn)另文報(bào)道）。

國(guó)內(nèi)外尚未建立檢測(cè)鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的間接ELISA 方法，因此建立一種快速靈敏的抗體檢測(cè)方法十分必要。本研究以純化、濃縮的鴨1 型甲肝病毒亞型為包被抗原，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了可檢測(cè)鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的間接ELISA 方法，且具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病毒株 MPZJ1206 株胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒（即鴨1 型甲肝病毒亞型）由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑 羊抗鴨IgG-HRP，購(gòu)自KPL 公司；TMB 顯色液，購(gòu)自武漢博士德公司；酶標(biāo)板，購(gòu)自Corning 公司。

1.3 間接ELISA 檢測(cè)方法的建立

1.3.1 病毒濃縮液的制備 以鴨胚成纖維細(xì)胞蝕斑純化的MPZJ1206 株胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒經(jīng)尿囊腔途徑接種12 日齡鴨胚，37 ℃溫箱孵化，逐日照蛋，棄去24 h 內(nèi)死胚，無(wú)菌收取48～96 h 內(nèi)死亡鴨胚的尿囊液。8 000 r/min 離心2 h，取上清，50 000 r/min 離心3 h，棄上清，取沉淀以PBS 懸浮，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化濃縮病毒。

1.3.2 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

采用方陣滴定法將純化的病毒濃縮液用pH 值9.6 的碳酸鹽緩沖液按照1∶200～1∶3 200 倍比稀釋，每個(gè)稀釋度包被一橫行，每孔100 μL，37 ℃作用1 h 后，4 ℃包被過(guò)夜（14 h）；倒空液體，PBST 洗滌3 次，5 min/次，甩干；10%脫脂乳37 ℃封閉2 h；棄去脫脂乳，洗滌同上，甩干；陽(yáng)性血清和陰性血清分別按照1∶50～1∶400 的倍比稀釋，每個(gè)稀釋度加一縱行，每孔加100 μL，37 ℃孵育60 min；洗板同上，甩干；加入羊抗鴨酶標(biāo)抗體（1∶500），100 μL/孔，37 ℃孵育45 min；洗板同上，甩干；每孔加入100 μL TMB 顯色液室溫避光顯色10 min；每孔加入100 μL 0.5 mol/L 硫酸終止顯色；酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm 值，P/N 比值最大時(shí)為最佳的抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.3.3 抗原最佳包被條件的確定 采用最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度，分別以37 ℃1 h 后4 ℃過(guò)夜（14 h）、37 ℃2 h、4 ℃過(guò)夜（14 h）3 種不同的包被條件包被，其他同上，確定抗原的最佳包被條件。

1.3.4 最佳血清工作時(shí)間的確定 血清分別以37 ℃45 min、60 min、90 min 過(guò)夜（14 h）3 種不同的孵育時(shí)間進(jìn)行孵育，其他同上，測(cè)定確定最佳血清工作時(shí)間。

1.3.5 酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間的確定 羊抗鴨酶標(biāo)二抗分別作用30、45、60 min 后進(jìn)行測(cè)定，以確定酶標(biāo)二抗的最佳工作時(shí)間。

1.3.6 臨界值的確定 取32 份DHAV-1 陰性鴨血清，按照已建立的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，求出OD450nm 平均值和標(biāo)準(zhǔn)差SD。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，OD450nm≥平均OD450nm值+3 SD 時(shí)，判為陽(yáng)性。OD450nm＜平均OD450nm值+3 SD 時(shí)，判為陰性。

1.3.7 特異性試驗(yàn) 以建立的分別檢測(cè)鴨抗H9N2 亞型禽流感病毒、鴨瘟病毒、水禽新城疫病毒、鴨坦布蘇病毒、雛番鴨細(xì)小病毒、鴨呼腸孤病毒的6 種病毒的高免陽(yáng)性血清和經(jīng)典肝炎型鴨1型甲肝病毒高免陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性血清對(duì)照，檢測(cè)其特異性。

1.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) （1）批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：用同批次制備病毒濃縮液，選取6 份不同抗體水平的陽(yáng)性血清樣品及1 份陰性血清樣品，分別于第1、2、3 天進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；（2）批間重復(fù)試驗(yàn)：用3 份不同批次制備的胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒濃縮液，選取6 份陽(yáng)性血清樣品及1 份陰性血清樣品，進(jìn)行批間重復(fù)檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.9 敏感性試驗(yàn) 將胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒高免陽(yáng)性血清做1∶800～1∶25 600 倍比稀釋，進(jìn)行間接ELISA。

1.3.10 符合率試驗(yàn) 以建立的試驗(yàn)方法對(duì)經(jīng)過(guò)血清中和試驗(yàn)檢驗(yàn)為陽(yáng)性的12 份鴨血清和檢驗(yàn)為陰性的8 份鴨血清進(jìn)行檢測(cè)，比較間接ELISA試驗(yàn)方法和血清中和試驗(yàn)的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化病毒的蛋白定量 將純化的全病毒用Thermo Scientific NanoDrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，檢測(cè)結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)濃度為2 502 μg/mL。

2.2 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定 方陣滴定法結(jié)果顯示，當(dāng)純化抗原的稀釋濃度為1∶800（即每孔抗原包被量為0.3128 μg），血清的稀釋度為1∶200 時(shí)，陽(yáng)性血清的OD450nm 值為1.120，接近1，陽(yáng)性與陰性O(shè)D450nm 比值最大為8.549。因此，抗原的最佳包被濃度為0.3128 μg/孔，血清的最佳稀釋度為1∶200（表1）。

表1 抗原和血清最適稀釋度測(cè)定

2.3 抗原最佳包被條件的確定37 ℃1 h 后4 ℃包被過(guò)夜P/N 值最高，包被效果較好（表2）。

表2 抗原最佳包被條件的確定

2.4 最佳血清工作時(shí)間的確定 當(dāng)鴨血清作用時(shí)間為60 min 時(shí)，P/N 值最高，靈敏度好（表3）。

表3 最佳血清工作時(shí)間的確定

2.5 酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間的確定 羊抗鴨IgG-HRP 二抗37 ℃作用45 min 時(shí)P/N 比值最大（表4）。

表4 酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間的確定

2.6 臨界值的確定 對(duì)32 份陰性血清的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算其平均OD450nm 值為0.139，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）為0.0128，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，即當(dāng)OD450nm≥0.177時(shí)判為陽(yáng)性，OD450nm＜0.177時(shí)判為陰性。

2.7 特異性試驗(yàn) 用上述已知的病毒高免陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA 試驗(yàn)，其OD450nm 值均小于陰陽(yáng)性臨界值，均呈陰性；而經(jīng)典肝炎型DHAV-1 陽(yáng)性血清和胰腺炎型DHAV-1 陽(yáng)性血清的OD450nm 值分別為0.855 和1.167，均明顯高于陰陽(yáng)性臨界值，即均為陽(yáng)性，表明該方法特異性強(qiáng)。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 間接ELISA 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為1.5%～5.1%，批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為3.2%～5.3%，均小于10%，結(jié)果表明該間接ELISA方法重復(fù)性較好（表5）。

表5 間接ELIS A 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

2.9 敏感性試驗(yàn) 將胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒陽(yáng)性血清分別做1∶800～1∶12 800 倍比稀釋，進(jìn)行間接ELISA。結(jié)果顯示，1∶6 400 稀釋后仍可檢測(cè)為陽(yáng)性，而1:12 800 稀釋的陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果低于0.177，無(wú)法判定（表6）。

2.10 符合率試驗(yàn) 對(duì)經(jīng)血清中和試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性的12 份血清樣品和檢測(cè)為陰性的8 份血清樣品，以建立的間接ELISA 方法分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率、陰性符合率均為100%。

表6 間接ELIS A 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

本研究建立了檢測(cè)胰腺炎型DHAV-1，即鴨1型甲肝病毒亞型（DHAV-1a）抗體的間接ELISA方法，并提出了判定標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)雛鴨體內(nèi)鴨1 型甲肝病毒亞型的抗體，有較強(qiáng)的特異性和準(zhǔn)確性，能快速檢測(cè)抗體，從而判斷是否存在該病毒的感染。該方法的建立為DHAV-1a 感染的預(yù)防和控制提供了一種新的檢測(cè)方法，既適宜于鴨群中大批量鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的監(jiān)測(cè)，還可用于鴨群接種疫苗后血清抗體消長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定及對(duì)疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)。

該間接ELISA 方法雖有簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在抗原制備較復(fù)雜、制備要求高等不足，且不能區(qū)別胰腺炎型DHAV-1（即DHAV-1a）抗體與經(jīng)典肝炎型DHAV-1 抗體，今后將進(jìn)一步研制單抗，以期建立可鑒別兩者抗體的血清學(xué)方法。

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