殷建建，胡 群，易子晴，劉 洋，易 丹，李文平

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410128）

蚯蚓作為一種中藥材，在我國應(yīng)用已經(jīng)有幾千年歷史，據(jù)《本草綱目》記載: 蚯蚓能治療瘰疬潰爛、口舌糜瘡，臨床上常用來治療骨折、創(chuàng)傷、下肢潰爛等疾病[1]。蚯蚓中含高度不飽和脂肪酸、核苷酸、酶類、蛋白質(zhì)、蚯蚓解熱堿等多種物質(zhì)，具有清熱定驚、止咳平喘、活血通絡(luò)、降壓、抗?jié)?、抗肝纖維化、利尿等功能。此外，現(xiàn)代分離技術(shù)發(fā)現(xiàn)，蚯蚓中還含有纖溶酶、抗菌肽、多種抗氧化酶等活性成分，因此具有止血鎮(zhèn)痛、促進創(chuàng)傷愈合、抗氧化、抗血栓、調(diào)節(jié)免疫、抗心律失常、抗癌等作用[2]。近幾年蚯蚓藥用價值越來越受到重視，臨床研究和應(yīng)用也日益廣泛。國內(nèi)外對蚯蚓創(chuàng)傷愈合作用的研究成為蚯蚓有效成分分離提純的新熱門。

目前，治療創(chuàng)傷的藥物主要以生物化學(xué)制劑內(nèi)服和中藥外敷為主。生物化學(xué)制劑對用藥者易產(chǎn)生藥物的依賴性和耐藥性,中藥可以有效縮短創(chuàng)面愈合時間、降低瘢痕發(fā)生率、安全毒副作用小等。中藥治療創(chuàng)傷應(yīng)用于臨床顯得尤為重要，因此，當前大量的研究人員研究蚯蚓提取物，為研發(fā)一種成分明確、藥效顯著、安全無毒副作用治療創(chuàng)傷的新型制劑而努力。本文對近年來蚯蚓提取物在治療動物創(chuàng)傷愈合作用的有效成分、分離純化、藥理作用和臨床研究進展等方面進行綜述，旨在為研發(fā)新型創(chuàng)傷類藥物提供前瞻性依據(jù)。

1 蚯蚓創(chuàng)傷愈合的有效成分及分離

1.1 抗菌肽 抗菌肽是生物免疫系統(tǒng)對抗自然界常在細菌等微生物侵襲的一種基本防御系統(tǒng)，具有廣譜的抗菌活性，對細菌、真菌等均具有一定作用，甚至對原蟲、病毒和腫瘤細胞也有作用。蚯蚓不僅具有大分子量的抗菌蛋白，而且具有抗菌活性的小分子多肽，且抗菌效果強，毒副作用小。對于蚯蚓抗菌肽的分離提純方法，目前主要采用層析和電泳技術(shù)兩種方法。

劉艷琴等采用硫酸銨沉淀—超濾—離子交換層析—Sephadex 凝膠過濾和C18 反相高壓液相等步驟從蚯蚓體腔液中分離純化出多種抗菌肽。Chao 等采用肝素親和層析和反相C18-HPLC 技術(shù)，從粉正蚓中分離、純化出一種新的抗微生物肽類，命名為lubricin。該成分為含脯氨酸的62 氨基酸肽類，cDNA 序列分析證明其為一種76 氨基酸的前體形式。張希春等通過硫酸銨沉淀、超濾和陽離子交換分離從蚯蚓勻漿液中得到了兩種新的抗菌肽F-1 和F-2。F-1 和F-2 的精確分子量分別為535.27 Da 和519.27 Da。孫振鈞通過超濾分離、分子篩柱層析、離子交換柱層析-脫鹽等步驟，從蚯蚓勻漿液中初步分離純化出一種抗菌四十肽。王莊[3-5]等通過電擊誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生抗菌肽、超濾濃縮脫鹽以及截取3～30 kD 的抗菌肽、陽離子交換、凝膠過濾層析分離提純得到3～30 kD 的蚯蚓抗菌肽。

1.2 抗氧化系成分 通常把具有抑制生物大分子過氧化或清除體內(nèi)自由基功效的生物活性肽稱為抗氧化活性肽（簡稱抗氧化肽）。蚯蚓提取物抗氧化作用主要是通過提高機體SOD、GSHPx、CAT 等體內(nèi)抗氧化酶系的活性完成[6]，被臨床證明具有良好的抗氧化、對抗炎癥損傷的作用。

廖怡[7]等采用閃式提取技術(shù)，從蚯蚓體內(nèi)提取出SOD、CAT，并通過羧甲基纖維素CM-22 離子交換層析實現(xiàn)SOD 和CAT 的聯(lián)合提取分離，并且在純化工藝中經(jīng)過丙酮沉淀和柱層析技術(shù)得到蚯蚓SOD 純品。商桂娜[8]等利用較超聲波提取法、組織勻漿法和閃式提取法3 種方法都提取得到了蚯蚓GSH-Px。周億金[9]等通過構(gòu)建超氧陰離子自由基和羥基自由基體系以及脂蛋白多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化體系,測定蚯蚓抗氧化提取物在鄰苯三酚自氧化體系中對超氧陰離子自由基、Fenton 反應(yīng)體系中對羥基自由基的清除作用及脂蛋白PUFA 過氧化體系中對脂質(zhì)體的抗氧化作用。Mariappan BALAMURUGAN[10]等利用Lampito mauritii 蚯蚓提取液對大鼠保護肝臟和抗氧化能力的試驗?zāi)Ｐ?，通過生化檢測肝臟GSH，SOD，GPx，CAT 等含量變化情況，證實水蛭蚯蚓提取液有增強肝組織的抗氧化能力。

1.3 纖溶酶 蚯蚓纖溶酶是從蚯蚓中分離的一種絲氨酸蛋白水解酶，具有直接溶解纖維蛋白的纖溶酶活性，又具有類尿激酶的纖溶酶原激活活性，是治療和預(yù)防血栓疾病的有效藥物。目前國內(nèi)外學(xué)者研究表明，蚯蚓纖溶酶具有抗凝血、溶血栓、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)修復(fù)等作用，尤其是溶栓作用，已經(jīng)成為現(xiàn)代臨床研究的熱門[11]。

目前纖溶酶的分離純化技術(shù)也較為成熟，一般分離步驟為:制備蚯蚓勻漿、鹽析（超濾分級）、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜或快速蛋白液相色譜法純化、電泳。

何執(zhí)中等用PB 液抽提、硫酸銨鹽析及凝膠過濾層析、離子交換層析等方法，分別從蚯蚓體腔液中分離得到分子質(zhì)量在29～36 ku 的纖溶活性組分，分子質(zhì)量為30 ku。陳美鳳等采用Sephadex G-100 及DEAE-52 離子交換纖維素兩種柱子進行分離純化，得到比活為7 000 mg/mL 的纖溶酶。Li L 等用加入了氨基比林酸的合成樹脂來分離蚯蚓組織勻漿中的糖基化組分，在用SDS-PAGE 法證明所分離組分的成分均一性后，采用質(zhì)譜法分析證明其分子質(zhì)量為34.193 kD。張汶婕[12]等采用超濾膜分級分離及DEAE-Sepharose fast flow 離子交換層析及Sephadex G-75 凝膠層析，從小于20 kD 廢液中分離出兩種電泳純蚯蚓纖溶酶同工酶。

1.4 鎮(zhèn)痛有效成分 臨床實踐表明，蚯蚓具有良好的創(chuàng)傷鎮(zhèn)痛，促進傷口愈合的作用。目前蚯蚓及其提取物已應(yīng)用于創(chuàng)傷、燙傷、燒傷、褥瘡等方面的治療。

崔泓等利用硫酸銨分段鹽析，DEAE 纖維素-DE52 離子交換層析，Sephadex-G100 凝膠層析技術(shù)分離到分子量為87000、72000、57000 的3 種蛋白質(zhì)，臨床發(fā)現(xiàn)蚯蚓液能縮短炎癥周期，其良好的抗炎能力與巨噬細胞的活化有關(guān)。隨后李冬實驗研究又表明，利用80 mg/L 濃度的氯化鎘（Cd-Cl2）溶液對蚯蚓進行誘導(dǎo)，再利用結(jié)合有Cu2+的金屬鰲合親和層析柱對粗提蛋白液進行初步分離，對分離液進行SDS-PAGE，再使用電泳洗脫純化，并對純化樣品的分子量和紫外吸收峰對其相應(yīng)的理化性質(zhì)進行鑒定，分離提純了分子量為14.4 kD 的金屬硫蛋白。

2 蚯蚓提取物對創(chuàng)傷愈合的作用機理

2.1 止血及解熱鎮(zhèn)痛作用 蚯蚓在中草藥中常被用作治血化瘀藥物，同時它還具有明顯的解熱鎮(zhèn)痛效果，但其解熱鎮(zhèn)痛作用機理尚不明確，可能與其具有的抗菌肽、鎮(zhèn)痛、抗氧化、改變血液流變等功效的多種活性物質(zhì)共同作用相關(guān)。

段平等把低劑量的蚯蚓纖溶酶用于大鼠體內(nèi)，能使得大鼠纖維蛋白原（Fbg）平均下降45%，凝血酶時間（TT）由11.13 s 延長到22.63 s（P＜0.01）。高劑量的溶栓酶除能明顯降低Fbg 和延長TT 外，可使凝血酶原時間（PT）由16.82 s 延長到73.44 s，白陶土部分凝血活酶時間（KPTT）由46.63 s 延長到124.13 s，并能使Ⅱ、Ⅷ因子降解，起到很強的抗凝效果。何執(zhí)中等試驗表明蚯蚓纖溶酶可以直接降解纖維蛋白和纖維蛋白原，還可以通過激活纖溶酶原而發(fā)揮間接作用。此外，蚯蚓纖溶酶可抑制血小板聚集，促使血管內(nèi)皮細胞分泌t-PA、水解凝血酶。陳學(xué)東等利用口服地龍煎液方法，觀察其出血時間和凝血時間表明，地龍煎液組出血、凝血時間與空白組、生理鹽水組比較均有顯著差異（P＜0.01），說明在24 h 內(nèi)連續(xù)服用2 次地龍煎液后,可以使人的出血、凝血時間明顯延長。

朱道辰等的研究表明，蚯蚓乙醇粗提物連續(xù)灌胃2 d，能顯著抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹，與空白對照組相比具有顯著差異（P＜0.05）。陳斌艷通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓粉劑具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，但與撲熱息痛并沒有協(xié)同作用。

2.2 抗菌消炎及抗氧化作用 蚯蚓對于抗菌、消炎方面的作用，主要通過蚯蚓體內(nèi)所含有的抗菌肽和抗氧化系成分來完成。

代萌等利用動物模型，用蚯蚓纖溶酶凝膠劑對大鼠足跖腫脹和小鼠耳腫脹進行試驗測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蚯蚓纖溶酶具有明顯的抗炎效果，而且其抗炎效果相當于5%氫化考的松[13]。李曾夏子[3]等證實，從蚯蚓體內(nèi)分離提純出的3～30 kD 抗菌肽對兔巴氏桿菌具有良好的防治效果，可以有效地在菌體表面產(chǎn)生空泡，抑制細菌生長，殺死細菌。Pan 等利用比色法測定蚯蚓體腔液對大腸桿菌、假單胞銅綠菌、嗜水產(chǎn)氣單胞菌3 種革蘭陰性菌和金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、節(jié)桿菌3 種革蘭陽性菌都具有明顯的抑制作用。

武金霞[14]等以鄰苯三酚自氧化體系檢測不同濃度蚯蚓凍干粉浸提物（EELP）對超氧陰離子的清除作用，以Fenton 反應(yīng)體系檢測其不同濃度下抑制羥基自由基產(chǎn)生的能力，證實一定濃度的EELP 具有一定抗氧化作用。周億金[9]等通過對成年小鼠按時定量地灌喂蚯蚓抗氧化提取物,測定其血液和肝臟抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量，檢測蚯蚓抗氧化提取物在成年小鼠體內(nèi)的抗氧化能力試驗表明，不同濃度的蚯蚓抗氧化提取物對成年小鼠血液及肝臟的SOD、CAT、GSH -Px活性的升高和MDA 含量的減少均有不同程度的影響，并且以10 倍稀釋的蚯蚓抗氧化提取物影響最顯著（P＜0.05），能有效降低小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平并且防止體內(nèi)抗氧化酶受自由基誘導(dǎo)的氧化損傷, 提高抗氧化酶的活性。Zhang[15]等用兩種不同濃度（5%、10%）的蚯蚓萃取液分別施加于Wistar 大鼠燙傷處表明，氧的消耗量和琥珀酸脫氫酶（SDH）活性降低，燙傷后席夫堿含量增加。

2.3 促進創(chuàng)傷愈合作用 張鳳春等在新西蘭大白兔背部傷口模型上用藥，試驗組在傷口上滴0.2 mL蚯蚓提取液，對照組在傷口上滴同量的0.02 mol/L pH 值為7.4 的磷酸緩沖液（PBS），于傷后5、7、10、14 d進行肉眼觀察，并取肉芽組織，分別做免疫組化ABC染色和電鏡觀察。分別用bFGF 和PBS 做陽性對照和陰性對照。結(jié)果顯示，用藥組肉芽組織中含大量肌纖維母細胞，合成功能活躍，肌肉組織中肌動蛋白增多，傷口收縮明顯，與陰性對照相比有顯著性差異，傷口修復(fù)較快。吳俊榮[16]等報道，蚯蚓外敷對兔耳瘢痕形成有抑制作用，可以減少創(chuàng)面炎性反應(yīng)，加速創(chuàng)面愈合，減少瘢痕的形成，并且減少瘢痕組織中成纖維細胞數(shù)量以及膠原的含量，減輕瘢痕纖維化程度,使得瘢痕軟化、變小，從而達到抑制瘢痕的作用。周瑩[17]等以MTT 法測定EFP 對大鼠成纖維細胞（NIH3T3）的促進增殖作用；細胞劃痕法測定EFP促進NIH3T3細胞劃痕創(chuàng)面愈合作用，MTT分析表明，不同濃度的EFP 都對NIH3T3 細胞都具有增殖作用，且這種促進增殖作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，不同濃度的EFP 都有促進NIH3T3 細胞劃痕創(chuàng)面愈合的作用，且這種促進劃痕創(chuàng)面愈合的作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

3 蚯蚓提取物對動物創(chuàng)傷的臨床應(yīng)用

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的不斷進步，蚯蚓越來越多的成分被不斷的發(fā)掘、研究和應(yīng)用，如纖溶酶、抗菌肽、纖溶酶原激活劑、乙酰膽堿酯酶、血管收縮素、鈣調(diào)素等。其中蚯蚓纖溶酶、抗菌肽和抗氧化成分已被制成相應(yīng)藥物，應(yīng)用于臨床。

崔漲等通過試驗首先確定了蚯蚓中存在促進成纖維細胞增生的活性物質(zhì)，并且發(fā)現(xiàn)其對成纖維細胞的作用存在量效關(guān)系，即在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加而作用增強，并有一最適濃度，高于此濃度時其作用降低，同時臨床發(fā)現(xiàn)蚯蚓液能減少滲出，縮短炎癥周期，加速傷口的愈合。

陳云峰對大白兔背部創(chuàng)傷模型的試驗研究，得出了蚯蚓能顯著加速肉芽組織生成，促進表皮生長，并且能使傷口創(chuàng)緣明顯收縮，從而提高傷口的愈合率，使愈合期提前的結(jié)論。還有應(yīng)用其醇提物作用于成纖維細胞，表明適當濃度的蚯蚓醇提液具有促進成纖維細胞生長的作用，高濃度時增殖下降。

章梅等采用大鼠深Ⅱ度燙傷模型，創(chuàng)面應(yīng)用蚯蚓提取物軟膏、類肝素軟膏，觀察其對大鼠深Ⅱ度燙傷早期創(chuàng)面病理變化和創(chuàng)面愈合的影響，并測定了燒傷創(chuàng)面含水量、血漿和燒傷創(chuàng)面抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ），纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP）含量，燒傷創(chuàng)面羥脯氨酸含量，Ⅰ/Ⅲ型膠原比例，真皮細胞增殖周期及創(chuàng)面愈合時間。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面外用蚯蚓提取物可以降低燒傷創(chuàng)面水腫程度，增加血漿AT-Ⅲ活性，增加燒傷創(chuàng)面FDP 含量，增加真皮細胞中DNA合成，減輕燒傷創(chuàng)面早期加深，縮短大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合時間。張鳳春等在對大鼠背部創(chuàng)傷愈合試驗表明，蚯蚓能顯著地增加肌肉組織中肌動蛋白數(shù)量，有利于傷口的收縮。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)蚯蚓組肉芽組織中的細胞生長旺盛。針對這一作用，王沛等對50 例痔結(jié)扎注射術(shù)的病人進行了臨床觀察，痔核脫落時局部噴灑蚯蚓組分溶液。結(jié)果平均愈合時間明顯縮短，表皮生長速度明顯加快，表明蚯蚓具有明顯的促進創(chuàng)傷愈合的作用。

蚯蚓提取物對燙傷愈合的臨床應(yīng)用雖進行了一些探索，關(guān)于蚯蚓組織成分對燙傷愈合作用的研究還處于初級階段，對燙傷愈合作用機制的研究還不多，其作用特點尚認識不足，這方面的工作還有待加強。

4 小結(jié)與展望

蚯蚓資源豐富，提取成本低廉，藥理作用明顯，生物技術(shù)處理后毒副作用小，療效確切，而且隨著國內(nèi)外對蚯蚓提取物的研究日益深入和廣泛，進行蚯蚓產(chǎn)品的研發(fā)具有十分廣闊的科學(xué)前景。但由于蚯蚓體內(nèi)成分復(fù)雜，有些作用機理尚不明確，國內(nèi)對蚯蚓的研究多集中于纖溶活性成分，一般多為一些小分子肽類及蛋白，對蚯蚓在創(chuàng)傷愈合、鎮(zhèn)痛等方面研究較少，導(dǎo)致我國開展蚯蚓藥理作用機制研究的步伐明顯滯后。同時，創(chuàng)傷愈合也是一個極其復(fù)雜的過程，涉及多個層面，盡管人類目前對其認識水平顯著提高，但在很多方面仍需深入研究。相信隨著生命科學(xué)的進步，蚯蚓提取物的作用機制更加清楚、有效成分更加明確、療效更加顯著，使其臨床應(yīng)用更合理、更有效、更廣泛。

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