韓寧寧，于麗娜，徐嫄，郝利華，趙暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

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頭孢氨芐不穩(wěn)定性對建立相應(yīng)復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的影響

韓寧寧，于麗娜，徐嫄，郝利華，趙暉*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

在獸用復(fù)方化學(xué)制劑頭孢氨芐單硫酸卡那霉素乳房注入劑的注冊檢驗過程中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)萃取所用的乙醚為國產(chǎn)分析純試劑時，頭孢氨芐會降解從而影響相應(yīng)含量測定與降解物檢查；在卡那霉素降解物檢查項中，供試品溶液制備過程中的加熱步驟會導(dǎo)致頭孢氨芐降解從而干擾該項測定。針對上述兩個問題進行研究后認為，申報方在標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)對試劑純度及卡那霉素降解物檢查項中空白的配制方法作出詳細規(guī)定。本實驗在為完善該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考的同時，也可為同業(yè)人員制定含有不穩(wěn)定主成分的獸用復(fù)方化學(xué)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒。

頭孢氨芐；單硫酸卡那霉素；試劑純度；不穩(wěn)定性

復(fù)方制劑由兩種或兩種以上藥物組成，在藥品注冊申請中已占有一定的比例，與單方制劑相比，其質(zhì)量研究工作更復(fù)雜，存在的問題也更多樣化。處方內(nèi)主成分的不穩(wěn)定性、主成分間的相互作用對雜質(zhì)檢查的影響都應(yīng)在相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)制定過程中給予關(guān)注。

近日，我們對某申報進口注冊的頭孢氨芐單硫酸卡那霉素乳房注入劑進行了注冊檢驗。該產(chǎn)品為復(fù)方制劑，其中頭孢氨芐屬第一代頭孢菌素，卡那霉素屬氨基糖苷類抗生素，二者合用，可提高后者在菌體內(nèi)的濃度，進而呈現(xiàn)協(xié)同作用[1]。然而，頭孢氨芐穩(wěn)定性差，遇酸遇熱均易分解[2]，這一特性對該復(fù)方制劑的含量測定及有關(guān)物質(zhì)檢查均會產(chǎn)生影響，需要在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立過程中加以注意。我們在對獸用復(fù)方化學(xué)制劑頭孢氨芐單硫酸卡那霉素乳房注入劑的注冊檢驗過程中也發(fā)現(xiàn)了這樣的問題并進行了研究。

1 材料與試藥

高效液相色譜儀(HPLC)，配紫外檢測器(UV)和二極管陣列檢測器(PDA)(Waters 2695-2487/996)；AX-205分析天平(Mettler Toledo)。分析純石油醚和乙醚購于國藥集團；色譜純乙醚和水購于Honeywell公司；液相用水為MILLI Q純水機過濾的純化水。頭孢氨芐對照品、卡那霉素對照品及7-氨基3-去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)對照品均由申報方提供。頭孢氨芐對照品批號20676，含量93.4%；卡那霉素對照品批號20889，含量779.1單位/mg；7-ADCA對照品批號WS00019，含量99.3%。供試品頭孢氨芐單硫酸卡那霉素乳房注入劑規(guī)格：10g：頭孢氨芐0.2g+卡那霉素10萬單位。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同純度級別的試劑對頭孢氨芐含量測定及頭孢氨芐降解物檢查的影響

2.1.1 申報方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定

2.1.1.1 【含量測定】頭孢氨芐 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01 mol/L 乙酸鈉溶液-乙腈-甲醇(910∶86.4∶3.6)為流動相；流速為1.5 mL/min；檢測波長為260 nm；理論板數(shù)按頭孢氨芐峰計算不低于1500。

測定法：精密稱取本品約0.5 g，置分液漏斗中，加乙醚25 mL和石油醚25 mL，搖勻，用水提取3次，每次25 mL，合并水液至100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，取25 uL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取頭孢氨芐對照品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成每1 mL中含頭孢氨芐0.1 mg的溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算供試品中頭孢氨芐的含量。

2.1.1.2 【檢查】7-ADCA和其他未知雜質(zhì)(頭孢氨芐降解物) 照頭孢氨芐含量測定項下的方法測定，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的1.5倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按下式分別計算7-ADCA、單個未知雜質(zhì)含量和雜質(zhì)總量，7-ADCA不得大于1.0%，單個未知雜質(zhì)不得大于1.0%，雜質(zhì)總量不得大于2.5%。

7-ADCA含量(%)=(7-ADCA峰面積/頭孢氨芐峰面積)×P×0.7

單個未知雜質(zhì)含量(%)=(未知雜質(zhì)峰面積/頭孢氨芐峰面積)×P×1

雜質(zhì)總量(%)=7-ADCA(%)+未知雜質(zhì)(%)+D-苯甘氨酸(%)

式中：0.7為7-ADCA的響應(yīng)因子；1為未知雜質(zhì)的響應(yīng)因子；P為頭孢氨芐的百分含量。

2.1.2 不同純度級別試劑影響的比較 在實驗初期發(fā)現(xiàn)，頭孢氨芐含量測定結(jié)果偏低(結(jié)果為約75%)，且供試品溶液色譜圖中保留時間約2.5 min及9.1 min附近有兩個較大的雜質(zhì)峰(圖1)超出了頭孢氨芐降解物項的規(guī)定。由于實驗初期萃取的溶劑均采用國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純試劑及MILLI Q純水機過濾的純化水，我們考慮是否有可能受到溶劑的影響導(dǎo)致頭孢氨芐的降解。

圖1 使用分析純乙醚和MILLI Q純水機過濾的水萃取的頭孢氨芐含量測定供試品溶液色譜圖

由于查詢到?jīng)]有色譜純石油醚，因此我們將剩余的兩種溶劑——乙醚和水全部更換為Honeywell公司生產(chǎn)的色譜純乙醚和水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)頭孢氨芐含量和降解物項均符合規(guī)定(圖2)。

圖2 使用色譜純乙醚和水萃取的頭孢氨芐含量測定供試品溶液色譜圖

然后又將色譜純乙醚更換回分析純乙醚，或者將色譜純水更換回MILLI Q純水機過濾的純化水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者仍存在含量低和降解物不符合規(guī)定的問題，而后者兩項結(jié)果均符合規(guī)定(表1)。至此，我們可以確定，國產(chǎn)分析純乙醚會導(dǎo)致該申報制劑中頭孢氨芐降解，進而影響測定結(jié)果。這可能是由于該分析純乙醚中的雜質(zhì)或者其偏酸性的pH值導(dǎo)致的。因此我們建議，申報方在標(biāo)準(zhǔn)中注明對萃取溶劑的要求。

表1 不同純度級別的試劑對頭孢氨芐含量測定及頭孢氨芐降解物檢查的影響

2.2 頭孢氨芐的不穩(wěn)定性對卡那霉素降解物檢查的影響

2.2.1 申報方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定

2.2.1.1 【含量測定】卡那霉素 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用辛基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Phenomenex Luna C8，5 μm，250 mm×4.6 mm色譜柱)；以水-乙腈(45:55)為流動相；流速為1.5 mL/min；檢測波長為350 nm；理論板數(shù)按卡那霉素峰計算不低于1500。

測定法：精密稱取本品約3.8 g，置250 mL分液漏斗中，加庚烷50 mL使主成分溶解，再用水提取3次，每次25 mL，合并水液至100 mL量瓶中，用0.4 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加0.15 mol/L 2,4-二硝基氟苯的甲醇溶液15 mL，在60 ℃水浴中加熱60 min，冷卻至室溫，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取10 uL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取單硫酸卡那霉素對照品約50 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算供試品中卡那霉素的含量。

2.2.1.2 【檢查】卡那霉素降解物 照卡那霉素含量測定項下的方法測定，記錄色譜圖至主成分保留時間的1.5倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按下式計算單個雜質(zhì)含量和雜質(zhì)總量，單個雜質(zhì)不得大于1.0%，雜質(zhì)總量不得大于2.0%。

雜質(zhì)含量(%)=雜質(zhì)峰面積/卡那霉素峰面積×P

式中：P為卡那霉素的百分含量。

2.2.2 頭孢氨芐不穩(wěn)定性對空白色譜圖的干擾 在實驗中發(fā)現(xiàn)，不加供試品的空白色譜圖中有多個色譜峰，可能是來源于萃取及稀釋所用的溶劑或衍生化試劑(圖3)。然而，將供試品圖譜中的空白峰不計后，卡那霉素降解物項仍不符合規(guī)定(保留時間為9.3 min及10.2 min的兩個雜質(zhì)含量均大于1.0%)(圖4)。考慮到該復(fù)方制劑中頭孢氨芐熱穩(wěn)定性差，而卡那霉素降解物檢查項中供試品溶液的制備過程，衍生化一步需要在60 ℃水浴中加熱60 min，這一操作可能導(dǎo)致頭孢氨芐降解，其產(chǎn)生的降解物峰有可能干擾卡那霉素降解物項的測定。

圖3 卡那霉素降解物檢查空白色譜圖

圖4 卡那霉素降解物檢查供試品溶液色譜圖

因此，我們參照供試品中的頭孢氨芐規(guī)格(10 g∶0.2 g)，模擬配制了含有相應(yīng)量的頭孢氨芐(3.8 g×0.2 g/10 g)的空白溶液，并將其進行與供試品相同的處理。以此溶液的色譜圖作為空白色譜圖(圖5)。將供試品圖譜中的該空白峰不計后，卡那霉素降解物項符合規(guī)定。因此我們建議，申報方在標(biāo)準(zhǔn)中注明空白溶液的制備方法。

圖5 添加頭孢氨芐的卡那霉素降解物檢查空白色譜圖

3 討論

申報進口注冊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草過程大多是在申報公司的所在國家完成，但是依據(jù)申報標(biāo)準(zhǔn)在我國進行注冊檢驗時，試劑、水等條件往往不同。尤其對于像頭孢氨芐這樣極其不穩(wěn)定的品種，不同純度級別的試劑就可能對其測定產(chǎn)生影響。因此，申報方應(yīng)盡可能對試驗條件進行詳細規(guī)定，以免產(chǎn)品本身合格而注冊檢驗結(jié)果出現(xiàn)不符合規(guī)定的情況。

與單方制劑相比，復(fù)方制劑雜質(zhì)檢查項研究工作更為復(fù)雜，不僅要考慮每種標(biāo)稱成分的穩(wěn)定性及輔料的影響，還要考慮標(biāo)稱成分之間相互作用的影響。練富林等[3]綜述了化學(xué)藥物復(fù)方制劑中雜質(zhì)的檢查與控制，其中總結(jié)了復(fù)方制劑中雜質(zhì)的歸屬分析步驟(圖6)。

圖6 復(fù)方制劑中雜質(zhì)的歸屬分析步驟[3]

對于復(fù)方制劑中可能存在的雜質(zhì)進行預(yù)測分析時，應(yīng)首先通過查閱復(fù)方制劑中各原料藥的相關(guān)文獻，了解原料藥中可能存在的雜質(zhì)，從而推測復(fù)方制劑中的雜質(zhì)；其次，對各原料藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)進行分析，并結(jié)合其生產(chǎn)工藝和制劑過程及貯藏條件，再推測可能因降解而產(chǎn)生的雜質(zhì)。對復(fù)方制劑中可能存在的降解產(chǎn)物進行初步預(yù)測后，選擇適宜的檢測方法，保證各主藥、雜質(zhì)和輔料能得到有效分離、檢出，并分別對各原料藥及其混合物、輔料、原料與輔料混合物、制劑等進行穩(wěn)定性考察，確定雜質(zhì)來源及種類。

復(fù)方制劑中含量測定或有關(guān)物質(zhì)檢查項的前處理條件要充分考慮到所有標(biāo)稱成分的影響，既要使測定方法具有專屬性，避免復(fù)方內(nèi)另一種或另幾種主成分的干擾，又要避免條件過于劇烈使測定成分本身降解。歸根結(jié)底，還是要對復(fù)方制劑中所有原料藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及穩(wěn)定性有充分了解與考察，才能設(shè)計相對合理的測定方法。

[1] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南化學(xué)藥品卷[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2010：31.

[2] 劉春萍，李賀一，吳志軍.頭孢氨芐片穩(wěn)定性考察[J].黑龍江醫(yī)藥，2001,14(3)：207.

[3] 練富林，李洪雪，施月芹, 等.化學(xué)藥物復(fù)方制劑中雜質(zhì)的檢查與控制[J].藥學(xué)進展，2009，33(3)：112.

(編輯：李文平)

The Influence of the Instability of Cefalexin on Establishment of the Quality Standard of the Corresponding Compound Preparation

HAN Ning-ning, YU Li-na, XU Yuan, HAO Li-hua, ZHAO Hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

During the registration test of veterinary compound preparation intramammary infusions of cephalexin and kanamycin monosulfate, two problems were found: when the ether used for extraction was analytical reagent, cephalexin degraded that would interfere with the content determination of cephalexin and the inspection of degradation of cephalexin; during the inspection of degradation of kanamycin, the heating process during the preparation of test sample solution could lead to degradation of cephalexin that would interfere with the determination.In view of the above two questions, the corresponding suggestions were put forward—the applicant should make detailed provisions on the purity of the reagent and the preparation method of the blank in the examination of the degradation of kanamycin.This paper could provide reference not only for the applier to improve the quality standard, but also for the peers to establish quality standard for compound chemical preparation which contains unstable principal components.

cephalexin; kanamycin monosulfate; purity of reagents; instability

韓寧寧，碩士，從事抗生素檢驗檢測工作。E-mail: hnn19841001@126.com

趙暉。E-mail: 171977364@qq.com

2015-08-04

A

1002-1280 (2015) 11-0034-04

S859.79