陸珉，黃青山，張繼恩

(1．復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳學(xué)研究所遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433；2．昆山博青生物科技有限公司，江蘇昆山215316)

?

重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的質(zhì)量研究

陸珉1,2，黃青山1,2，張繼恩2*

(1．復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳學(xué)研究所遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433；2．昆山博青生物科技有限公司，江蘇昆山215316)

對(duì)重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片進(jìn)行質(zhì)量研究。考察泡騰片外觀性狀、鑒別、酸堿度、融變時(shí)限、微生物限度、發(fā)泡量、重量差異以及含量測(cè)定(主要針對(duì)含量測(cè)定進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證)，確定泡騰片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)考察泡騰片的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片外觀性狀、鑒別、酸堿度、融變時(shí)限、微生物限度、發(fā)泡量、重量差異結(jié)果符合要求，含量測(cè)定為標(biāo)示量的80%～150%。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明在干燥、陰涼、密封條件下，重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片至少能保質(zhì)24個(gè)月。由此確定泡騰片質(zhì)量符合擬定的企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

重組溶葡萄球菌酶；陰道泡騰片；質(zhì)量研究

母豬陰道炎是母豬繁殖障礙病中的主要疾病之一，引發(fā)豬陰道炎的病原細(xì)菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌等。調(diào)查顯示，母豬陰道炎發(fā)病率高，且治愈率低。目前尚缺少相應(yīng)的生物新型藥物治療母豬陰道炎[1-3]。重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片是一種用于治療哺乳動(dòng)物陰道炎的陰道泡騰片劑。該制劑通過(guò)給藥進(jìn)入哺乳動(dòng)物陰道后，能夠在體液的作用下泡騰崩解，使藥物混合于泡沫中快速釋放，藥物與陰道黏膜的接觸面積更大，使藥物能滲入黏膜褶皺深部，延長(zhǎng)藥物與黏膜作用時(shí)間，提高局部組織藥物濃度，進(jìn)而增強(qiáng)治療效果，有效殺滅由葡萄球菌、鏈球菌等引起的細(xì)菌性陰道炎。本研究考察重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片外觀性狀、鑒別、酸堿度、融變時(shí)限、微生物限度、發(fā)泡量、重量差異以及含量測(cè)定，同時(shí)考察陰道泡騰片的穩(wěn)定性，以期建立重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 W-CJ-2D型雙人超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；HTY-300型微生物限度檢測(cè)儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)；UV757型紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司)；融變時(shí)限儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；FA2004電子天平(上海方瑞儀器有限公司)。

1.2 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉培養(yǎng)基(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(上海盛思生化科技有限公司)，色源底物KNR-PG(偶聯(lián)活性艷藍(lán)染料KNR的金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖)；溶葡萄球菌酶工作參考品(上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司，290 U/支，批號(hào)：20130403)；甘氨酸(上?；菖d生化試劑有限公司)；氫氧化鈉(上海山浦化工有限公司)；Tris，HCl(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)。

重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片3批，批號(hào)：20110301、20110302、20110401、20141101、20141102、20141103，昆山博青生物科技有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 樣品檢測(cè) 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片，按2010年版《中華人民共和國(guó)獸藥典》[4]及2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》[5]要求，對(duì)外觀性狀、鑒別、酸堿度、融變時(shí)限、微生物限度、發(fā)泡量、重量差異進(jìn)行測(cè)定。

2.2 含量測(cè)定 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片1片，精密加0.05 mol/L Tris-鹽酸緩沖液20 mL，使成每1 mL中約含10單位的溶液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液，以重組溶葡萄球菌酶標(biāo)準(zhǔn)品作為校準(zhǔn)，照農(nóng)業(yè)部公告的方法測(cè)定[6]。

重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片由于其配方、作用原理及使用方法與原有的重組溶葡萄球菌酶粉不同，在檢測(cè)時(shí)需提前進(jìn)行泡騰溶解，在泡騰時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定體積的泡沫，因此，在選擇色源底物比色法作為重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的酶含量檢測(cè)方法時(shí)，對(duì)該方法重新進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證。主要從重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的特點(diǎn)出發(fā)，考察現(xiàn)有檢測(cè)方法在測(cè)定重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片時(shí)的線性范圍、準(zhǔn)確性、精密性、專屬性及耐用性等方面是否符合相關(guān)要求。

2.2.1 線性與范圍 按表1所示，取一定量酶活測(cè)定供試品溶液用于測(cè)定，按管號(hào)加入對(duì)應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)品品溶液，共測(cè)定10個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度重復(fù)測(cè)定3份。

表1 線性與范圍測(cè)定

2.2.2 準(zhǔn)確性 用重組溶葡萄球菌酶標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，取泡騰片樣品泡騰于20 mL體積純化水中，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取泡騰液50 μL加樣，進(jìn)行酶含量測(cè)定，同時(shí)取一粒泡騰片所需的壓制前混合粉，溶解泡騰于同樣體積中，取泡騰液進(jìn)行含量測(cè)定，另取以制備該批泡騰片所用的同批次同等量的酶粉作為對(duì)照，檢測(cè)陰道泡騰片劑樣品中的重組溶葡萄球菌酶在不同時(shí)期酶含量的回收率。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

以標(biāo)準(zhǔn)品活性(U/mL)與相對(duì)應(yīng)的OD595值進(jìn)行線性回歸，求得回歸曲線方程及曲線參數(shù)，根據(jù)樣品測(cè)得的OD595值與回歸方程求得樣品的酶活性。以溶葡萄球菌酶酶粉測(cè)定結(jié)果為100%標(biāo)示量，比較其他兩組樣品對(duì)標(biāo)示量的回收率及比較3組測(cè)定值的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

2.2.3 試驗(yàn)內(nèi)精密度 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片酶活測(cè)定供試品溶液，加樣體積分別為30、50、70 μL，每個(gè)體積加平行10管，依法測(cè)定。

2.2.4 試驗(yàn)間精密度 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片酶活測(cè)定供試品溶液，加樣體積分別為30、50、70 μL，每個(gè)體積加平行3管，依法測(cè)定。共進(jìn)行3次，由不同檢測(cè)人員分別測(cè)定。

2.2.5 專屬性 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片酶活測(cè)定供試品溶液，進(jìn)行酶含量測(cè)定，同時(shí)不含溶葡萄球菌酶的空白陰道泡騰片作為對(duì)照品，同法進(jìn)行泡騰及測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的穩(wěn)定性試驗(yàn)包括加速試驗(yàn)、長(zhǎng)期留樣試驗(yàn)兩部分。根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄246“獸藥穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”要求，對(duì)重組溶葡萄球菌酶泡騰片進(jìn)行4500lx±500lx照度條件下的光照影響因素試驗(yàn)；(60±2)℃及(40±2)℃條件下的高溫影響因素試驗(yàn)；90%±5%、75%±5%及65%±5%的高濕影響因素試驗(yàn)；(30±2)℃、相對(duì)濕度(65±5)%條件下的加速試驗(yàn)和(25±2)℃、相對(duì)濕度(60±10)%條件下長(zhǎng)期試驗(yàn)。樣品分組與評(píng)價(jià)方法如下：

2.3.1 光照影響因素試驗(yàn)組 從20110301批中選取20片，除去外包裝，平鋪于開(kāi)口容器中，放置于照度為4500lx±500lx的光照箱中。分別于0、5、10 d隨機(jī)取出樣品，對(duì)外觀性狀、融變時(shí)限、吸濕率、酶含量及重量差異進(jìn)行評(píng)價(jià)。

吸濕率檢測(cè)方法，取檢測(cè)樣品，在0 d精密測(cè)定重量，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)再次精密測(cè)定重量，與0 d時(shí)樣品重量相比較，觀察樣品重量差異變化，得出吸濕增重率。

2.3.2 高溫影響因素試驗(yàn)組 從20110301批中選取40片，除去外包裝，平鋪于開(kāi)口容器中，分別放置于溫度為(60±2)℃及(40±2)℃的恒溫箱中，各20片。分別于0、5、10 d隨機(jī)取出樣品，對(duì)外觀性狀、融變時(shí)限、吸濕率、酶含量及重量差異進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3.3 高濕影響因素試驗(yàn)組 從20110301批中選取60片，除去外包裝，平鋪于開(kāi)口容器中，分別放置于濕度為90%±5%、75%±5%及65%±5%的恒濕密閉容器中，各20片。分別于0、5、10 d隨機(jī)取出樣品，對(duì)外觀性狀、融變時(shí)限、吸濕率、酶含量及重量差異進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3.4 加速試驗(yàn)組 從20110301、20110302、20110401批中選取60片，共180片，用一容器按批次分區(qū)排放，放置于溫度為(30±2)℃、濕度為(65±5)%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)。于0月、1月、2月、3月及6月隨機(jī)取出樣品，對(duì)外觀性狀、融變時(shí)限、吸濕率、微生物限度及酶含量進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中微生物限度檢查項(xiàng)僅在穩(wěn)定性試驗(yàn)開(kāi)始與結(jié)束時(shí)檢測(cè)。

2.3.5 長(zhǎng)期留樣試驗(yàn)組 從20110301，20110302，20110401批中隨機(jī)取80片，共240片，用一容器按批次分區(qū)排放，放置于溫度為(25±2)℃、濕度為(60±10)%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)。于0月、3月、6月、9月、12月、18月、24月、36月隨機(jī)取出樣品，對(duì)外觀性狀、融變時(shí)限、吸濕率、微生物限度、及酶含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，第24月，36月檢測(cè)發(fā)泡量。其中微生物限度檢查項(xiàng)僅在0月、12月、24月、36月時(shí)檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品檢測(cè)

3.1.1 外觀性狀 20141101、20141102和20141103批次樣品均為片形一致，片面光潔、色澤均勻、質(zhì)硬的類白色片劑。

3.1.2 鑒別 按照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》附錄VIIIB免疫斑點(diǎn)法，陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)呈明顯色帶，陰性結(jié)果不顯色。結(jié)果如圖1所示。

圖1 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片免疫斑點(diǎn)法鑒別結(jié)果(1.陽(yáng)性對(duì)照，2.樣品20141101，3.樣品20141102，4.樣品20141103，5.陰性對(duì)照)

3.1.3 酸堿度 20141101、20141102和20141103批次樣品酸堿度結(jié)果分別為6.9，6.9，7.0。符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的6.0～8.0。

3.1.4 融變時(shí)限、微生物限度、發(fā)泡量 20141101、20141102和20141103批次樣品融變時(shí)限、微生物、發(fā)泡量均符合獸藥典要求。

3.1.5 重量差異 20141101、20141102和20141103批次樣品重量差異均小于±2%，符合獸藥典要求。

3.2 含量測(cè)定 結(jié)果如表2所示。3批次樣品的酶含量均在標(biāo)示量的80%～150%之間，符合擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表2 3批重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的含量測(cè)定結(jié)果

3.2.1 線性與范圍 結(jié)果如表3所示。反應(yīng)體系中酶終濃度在0.2～1.0 U/mL范圍內(nèi)具有很好的線性，因此，將測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍定為0.2～1.0 U/mL。

表3 3次線性范圍試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3.2.2 準(zhǔn)確性 結(jié)果如表4所示。用標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以制備泡騰片樣品的同批次等量酶粉作為對(duì)照，測(cè)定泡騰片成品及泡騰片混合粉在泡騰后的酶含量，計(jì)算回收率，同時(shí)加入不同的測(cè)活體積，試驗(yàn)了此方法測(cè)定溶葡萄球菌酶生物活性的準(zhǔn)確性。由結(jié)果可見(jiàn)，測(cè)定方法的準(zhǔn)確性高，加入不同的測(cè)活體積的結(jié)果無(wú)明顯差別，泡騰片成品的泡騰液經(jīng)回算后回收率分別達(dá)到103%、99%、97%。

表4 三次試驗(yàn)回收率結(jié)果(n=3)

3.2.3 試驗(yàn)內(nèi)精密度 結(jié)果如表5所示。同一試驗(yàn)內(nèi)不同濃度樣品測(cè)定的變異系數(shù)均<10%，表明測(cè)定方法一試驗(yàn)內(nèi)精密性高。

3.2.4 試驗(yàn)間精密度 結(jié)果如表6所示。多次試驗(yàn)間不同濃度樣品測(cè)定的變異系數(shù)均<10%，表明測(cè)定方法在多次試驗(yàn)間的精密性高。

表5 不同加樣體積測(cè)定結(jié)果

表6 三次不同加樣體積的測(cè)定結(jié)果

3.2.5 專屬性 結(jié)果如表7所示。以不含溶葡萄球菌酶的空白泡騰片為對(duì)照，在泡騰片酶濃度測(cè)定正常的同時(shí)，空白泡騰片完全測(cè)不出有酶活性。表明測(cè)定方法的專屬性好。

表7 三次不同樣品的OD595測(cè)定值及酶含量(U/粒)

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 光照影響因素試驗(yàn)結(jié)果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在4500±500lx光照強(qiáng)度下，10 d的考察期內(nèi)，酶活性等各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化。

3.3.2 高溫影響因素試驗(yàn)結(jié)果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在(60±2)℃高溫條件下，10 d的考察期內(nèi)，酶活性有較明顯的下降，其他無(wú)明顯變化，(40±2)℃高溫條件下，10 d的考察期內(nèi)，酶活性等各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化。

3.3.3 高濕影響因素試驗(yàn)結(jié)果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在95%±5%及75%±5%高濕條件下，10 d的考察期內(nèi)，片劑外觀變不平整，吸濕重量增加明顯，酶含量有一定下降，其他指標(biāo)無(wú)明顯變化，在65%±5%濕度條件下各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化。實(shí)際生產(chǎn)中環(huán)境濕度都控制在低于65%以下。

3.3.4 加速實(shí)驗(yàn)結(jié)果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在(30±2)℃條件下，6個(gè)月的考察期內(nèi)，外觀性狀、微生物、酶活性等各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化。

3.3.5 長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在(25±2)℃條件下，36個(gè)月的考察期內(nèi)，外觀性狀、微生物、酶活性等各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化。

4 討論與小結(jié)

含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，在色源底物法的測(cè)定條件下，反應(yīng)體系中酶終濃度在0.2～1.0 U/mL范圍內(nèi)具有很好的線性，相關(guān)系數(shù)均為99.9%以上，多次測(cè)定回歸曲線相關(guān)系數(shù)的CV<5%。因此，將測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍定為0.2～1.0 U/mL。且色源底物法測(cè)定的準(zhǔn)確性好、精密性高、專屬性好，適宜于大量樣品的測(cè)定，可以用于重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的溶葡萄球菌酶生物活性的定量測(cè)定。

檢測(cè)結(jié)果顯示，重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片外觀形狀、鑒別、酸堿度、融變時(shí)限、微生物限度、發(fā)泡量、重量差異結(jié)果符合要求，含量測(cè)定為標(biāo)示量的80%～150%。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明：溫度、濕度是重組溶葡萄球菌酶泡騰片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂和運(yùn)輸保存必須考慮的關(guān)鍵指標(biāo)；干燥、陰涼、密封是重組溶葡萄球菌酶泡騰片最佳保存溫度條件，并至少能保質(zhì)24個(gè)月。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)母豬陰道炎的治療方法主要有消毒劑治療，抗生素注入，或者兩者相結(jié)合治療。消毒劑沖洗常用1000 mg/mL高錳酸鉀或者500 mg/mL新潔爾滅沖洗陰道或者洗必泰栓給藥治療[7]?？股刈⑷雵?guó)內(nèi)主要用土霉素注入劑，國(guó)外則通常在分離致病菌后進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試再選用四環(huán)素類，磺胺類，青霉素類，氨基糖苷類或呋喃類抗生素[8-9]。消毒劑治療由于通常要進(jìn)行大量沖洗，粘膜受刺激較大，外陰紅腫強(qiáng)烈且治療效果不佳?？股仡愃幬镏委煏?huì)抑制陰道內(nèi)有益細(xì)菌的正常生長(zhǎng)，破壞陰道內(nèi)的微生態(tài)平衡，致病菌大量繁殖，增加了治療難度；而且長(zhǎng)期使用抗生素，極易使致病菌產(chǎn)生耐藥性。重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片作為一種生物酶制劑與抗生素、化學(xué)藥物有著完全不同的殺菌機(jī)理，沒(méi)有藥物殘留問(wèn)題。重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的研制為治療母豬陰道炎提供了一種新的選擇。

[1] Stephen P Hawser.Lysostaphin and clarithromycin: a promising combination for the eradication of Staphylococcus aureus biofilms[J].Letters to the Editor / International Journal of Antimicrobial Agents，2011,37 (6): 585-587.

[2] 林莉,王德容,陳勇,等.“蒲公英散”治療母豬陰道炎的療效觀察[J].畜牧市場(chǎng),2010,5:50-52.

[3] Schmelcher，MAMPowell，SCBecker，etal.Chimeric phage lysins act synergistically with Lysostaphin to kill mastitis causingStaphylococcusaureusin murine mammary glands[J].Appl Environ Microbiol,2012,1:1-19.

[4] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典2010年版一部[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2010.

[5] 中國(guó)藥典委員會(huì)．(2010)中華人民共和國(guó)藥典 2010年版三部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010．

[6] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第1653號(hào)公告．重組溶葡萄球菌酶粉附2重組溶葡萄球菌酶活性測(cè)定法[S].

[7] 衛(wèi)永明,吳國(guó)良,李光良.高錳酸鉀溶液結(jié)合抗生素治療母豬膿性陰道炎[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,1995，(5)：7．

[8] Maes,D.,M.Verdonck,A.D.Kruif.Vaginal microecology and vulval discharge in swine[M].Belgium.1999: 39-50.

[9] Oravainen J.Field studies on infectious reproductive diseases and lameness in sows[M].Helsinki:University of Helsinki，2008：1-37．

(編輯：侯向輝)

Quality Research of the Recombinant Lysostaphin Vaginal Effervescent Tablets

LU Min1，2，HUANG Qing-shan1，2，ZHANG Ji-en2*

(1．StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering，InstituteofGenetics，SchoolofSciencesFudanUniversity，Shanghai200433，China；2．KunShanBiogreenTechnologyCO.,Ltd,Kunshan,Jiangsu215316,China)

To assess the recombinant lysostaphin vaginal effervescent tablets，indicators,such as appearance，identification，pH,melt time,microbial limit,foam volume,weight variation,and assay,were investigated.In addition,the methodology of content determination was validated.And the stability of the tablet was investigated.The results showed that appearance，pH，melt time,microbial limit,foam volume,weight variation of the tablet were conform to the requirement.The content of the results was from 80% to 150% of labelled amount.Under the conditions of dry,cool and seal,the storage phase of the tablet reached at least 24 months.Thus it was confirmed that quality of the tablet was conform to the standard of the enterprise.

recombinant lysostaphin；vaginal effervescent tablets；quality research

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2012GA690003)

陸珉，碩士研究生，工程師，從事生物酶制劑質(zhì)量研究。

張繼恩。E-mail：jienzhang@163.com

2015-09-18

A

1002-1280 (2015) 12-0014-06

S852.61