胡泓博，夏傳余，李光武

芳香療法在最古老的文明歷史中早有記載，至今已有六千多年的歷史。丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)，從丁香油或其它含丁香酚的芳香油中蒸餾分離而得。具有抗氧化［1］、抗驚厥［2］、解熱抗炎［3］和局部麻醉［4］等多種藥理活性，在腦血管疾病、老年性癡呆、神經(jīng)障礙、癲癇的防治中得到廣泛應用。本實驗室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)丁香酚通過嗅覺通路能改善小鼠學習記憶能力、引起海馬和杏仁核的乙酰膽堿(Ach)等神經(jīng)遞質(zhì)的變化［5，6］。已有實驗證明丁香酚腹腔注射對大鼠局灶性腦缺血/再灌注神經(jīng)保護作用［7］。因注射給藥方式不便應用于臨床，穩(wěn)定性差，本試驗運用大腦中動脈內(nèi)線栓阻斷法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制造大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，通過丁香酚吸嗅途徑，探討丁香酚通過嗅覺通路對腦缺血損傷的保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠，60 只，體重220 g 左右，安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。置于安靜、室溫(25±1)℃、濕度(55±2)%、自然光照的動物飼養(yǎng)室中，自由飲水及攝食，適應性飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

DMS-2 型Morris 水迷宮測試系統(tǒng)(上海欣曼科教設備有限公司提供);2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma 公司);Leica 石蠟病理切片(RM2135型，德國);顯微鏡(Nikon80i 型 日本);SABC 試劑盒(SP-9000，K136824B，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DAB 顯色試劑盒(ZLI-9018，K132429A，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗BDNF 抗體(bs-0248R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)等。

1.3 大鼠腦缺血再灌注模型的建立

SD 大鼠10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。在CCA 遠心端和近心端及ECA 處掛線備用。用動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。然后在距CCA 分叉部4 mm 處剪一小口，將標記好的魚線插入到ICA，進入ECA 與ICA 分叉處時打開動脈夾迅速插入ICA，進入深度約18 mm，系牢CCA 遠心端的細線，將魚線尾端用黑色記號筆涂黑后留于皮膚外1 cm，消毒并縫合。2 h 后，輕輕向外抽拉魚線至ECA 主干，恢復血供，大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食。

1.4 分組及給藥

SD 大鼠80 只隨機分為4 組，每組20 只:模型組、丁香酚吸嗅組、假手術(shù)組(僅把魚線插入CCA6 mm 處，不阻塞大腦中動脈，結(jié)扎CCA 和ECA)、正常組。丁香酚吸嗅組:將丁香酚、蒸餾水以1∶99 濃度配置，盛放于香薰燈內(nèi)，置于在密閉的香薰桶底部，并加熱，將大鼠放置中間帶孔平臺上，將實驗盒蓋蓋上，每天吸嗅2 次，每次吸嗅1 h，吸嗅3 w;其余組于潔凈空氣中自然飼養(yǎng)。

1.5 神經(jīng)功能評分

參照Longa 評分標準［8］對大鼠進行神經(jīng)功能評分。無功能障礙為0 分;不能伸展左側(cè)前肢為1 分;向左側(cè)旋轉(zhuǎn)為2 分;向左側(cè)傾倒為3 分;無自主活動意識為4 分;死亡為5 分。術(shù)后24 h 后評分為1～3分為實驗用鼠。干預3 w 后每組隨機選取6 只動物用于神經(jīng)功能評分(見表1)。

1.6 TTC 染色及梗死面積測定

干預3 w 后模型組、丁香酚吸嗅組、假手術(shù)組各隨機選取7 只斷頭取腦，連續(xù)行2 mm 冠狀切片，2%TTC 溶液，37℃孵育30 min，4%多聚甲醛固定。未被TTC 染色的白色區(qū)域為梗死區(qū)掃描腦片，利用Image J1.41 圖像分析軟件計算梗死面積。

1.7 Morris 水迷宮實驗

吸嗅3 w 后，通過Morris 水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力，包括定位航行實驗和空間探索實驗。水迷宮為一直徑150cm、高40cm 的圓形水池，水深25cm，與計算機相連的攝像機位于迷宮正上方，用于同步大鼠運動軌跡。水迷宮分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及Ⅳ象限，在目標象限(第Ⅱ象限)中放置直徑10cm 的平臺，沒入水下2cm。實驗時水溫控制在22～24 ℃，用墨汁將迷宮內(nèi)水染成黑色。實驗前先將大鼠放入迷宮中熟悉環(huán)境，訓練2 d，每日進行2 次測試(上下午各1 次)。

1.7.1 定位航行實驗 受將大鼠從Morris 水迷宮的4 個不同象限的固定入水點投入水池中。記錄2 min 內(nèi)尋找平臺的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min 內(nèi)找到平臺，記錄其實際逃避潛伏期;如果大鼠在2 min 內(nèi)未找到平臺，將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期記錄為2 min。每天一次(下午2:00，時間固定)，實驗進行6 d。

1.7.2 空間探索試驗 7 d 時撤出平臺，然后在第Ⅳ象限同一入水點將大鼠投入水池中，測其2 min內(nèi)穿越原平臺所在位置的次數(shù)。

1.8 樣本取材及海馬CA3區(qū)BDNF 免疫組化

水迷宮試驗后，將大鼠麻醉，0.9%生理鹽水心臟灌注，斷頭取腦，腦組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，SABA 法免疫染色。每組取5張切片，400 倍顯微鏡下觀察和拍照。采用(Image-Pro Plus)6《專業(yè)圖像分析軟件》分析所得圖片，并比對大鼠大腦圖譜，對大鼠海馬CA3區(qū)進行圖像分析，檢測BDNF 在海馬CA3區(qū)陽性反應物平均光密度。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)采用±s 表示，組間均數(shù)的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

見表1。評分結(jié)果顯示，丁香酚組對腦缺血模型大鼠的神經(jīng)功能有不同程度的保護作用。丁香酚組與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。

2.2 TTC 染色結(jié)果

大鼠腦缺血/再灌注后均出現(xiàn)不程度的缺血梗死，丁香酚組梗死灶面積/腦切片面積與模型組比較明顯降低，差異有顯著性(P＜0.01)(見圖1、表2)。

2.3 Morris 水迷宮實驗結(jié)果

Morris 水迷宮實驗結(jié)果見表3，在定位航行實驗中，模型組的逃避潛伏期最長，明顯長于正常組和假手術(shù)組(P＜0.05);而丁香酚吸嗅組的逃避潛伏期短于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);在空間探索實驗中(見圖3)，模型組的動物存在明顯記憶障礙，每分鐘穿越隱匿平臺位置平均次數(shù)最少，并且常有朝向錯誤，與正常組比較差異有顯著性意義(P＜0.05);丁香酚吸嗅組的平均探索次數(shù)明顯多于模型組，兩者比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。

2.4 丁香酚吸嗅對MCAO 模型大鼠腦組織海馬CA3區(qū)免疫組化BDNF 蛋白表達量的影響

根據(jù)大鼠腦海馬區(qū)定位圖譜，本實驗腦組織海馬CA3區(qū)免疫組化BDNF 蛋白表達量采用(Image-Pro Plus)6《專業(yè)圖像分析軟件》分析所得圖片平均光密度經(jīng)組間比較，丁香酚組、正常組、假手術(shù)組與模型組P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義(見圖4)。假手術(shù)組、正常組BDNF 的免疫反應呈強陽性，免疫反應物為棕褐色，分布于胞漿內(nèi);丁香酚組BDNF 的免疫反應中等;模型組BDNF 的免疫反應較弱，且細胞數(shù)量減少(見圖5)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

與模型組比較△P＜0.01

表2 TTC 染色梗死面積(±s)

表2 TTC 染色梗死面積(±s)

與模型組比較△P＜0.01

表3 丁香酚吸嗅對大鼠逃避潛伏期的影響(±s)

表3 丁香酚吸嗅對大鼠逃避潛伏期的影響(±s)

與模型組相比* P＜0.05;與模型組相比△P＜0.01

圖1 TTC 染色結(jié)果

圖2 丁香酚吸嗅對大鼠逃避潛伏期的影響(±s，n=10)

圖3 空間探索實驗穿越平臺次數(shù)(±s，n=10)

圖4 腦組織海馬CA3區(qū)免疫組化BDNF 蛋白表達量平均光密度結(jié)果比較(±s，n=10)

圖5 海馬CA3區(qū)BDNF 的免疫組化(SABC×400)

3 討論

腦缺血，是指各種原因引起的腦部血液供應障礙，使局部腦組織發(fā)生不可逆性損害，導致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應的神經(jīng)功能缺損癥狀，具有發(fā)病率高、致殘率高、預后差、易復發(fā)的特點，居腦血管病死亡原因之首。目前對缺血再灌注性腦損傷后繼發(fā)引起神經(jīng)細胞損傷的發(fā)病機制并無定論。氧化損傷、免疫炎癥介質(zhì)釋放、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失與釋放與腦缺血再灌注損傷病程及損傷程度密切相關［9］，在臨床上尚無針對神經(jīng)元損傷后的神經(jīng)細胞保護藥物。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)于1982年Brade 等首次從豬腦中純化得出，發(fā)現(xiàn)其具有防止神經(jīng)元死亡功能并廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種蛋白質(zhì)［10］。BDNF 表達廣泛，包括大腦皮質(zhì)、海馬、基底前腦、紋狀體、下丘腦、小腦，其中皮質(zhì)和海馬含量最高［11］。BDNF 于腦缺血的早期階段即可被誘導大量表達，作用于腦缺血再灌注損傷的各個環(huán)節(jié)，并能從多個方面抑制腦缺血再灌注后的各種有害反應，起到極為重要的神經(jīng)保護作用［12］。主要表現(xiàn)在以下幾方面:

(1)抑制神經(jīng)細胞凋亡:通過體外給予每天2.1 μg BDNF 的輸液泵治療，2 d 后，深靜脈閉塞的大鼠平均腦梗死體積明顯減小，TUNEL 陽性凋亡細胞檢測明顯小于對照組［13］。

(2)抑制炎癥反應:BDNF 不僅減少局部促炎癥因子，也增加局部抗炎癥因子。給予外源性的BDNF下調(diào)腦組織TNF-α 蛋白及其mRNA 的水平，上調(diào)IL-10 和其mRNA 的水平。可見BDNF 可以通過抑制炎癥反應實現(xiàn)神經(jīng)保護作用［14］。

(3)修復神經(jīng)元損傷，促進神經(jīng)元再生:神經(jīng)元和軸突損傷后局部BDNF 蛋白表達不僅能刺激軸突發(fā)育和突觸形成，而且BDNF、成纖維細胞生長因子和神經(jīng)生長因子能提高內(nèi)皮細胞的分離和分化，并刺激血管生成，實現(xiàn)神經(jīng)功能修復［15］。

(4)拮抗興奮性氨基酸(EAA)毒性:BDNF 可以減少NMDA 受體亞單位基因表達，下調(diào)NMDA 受體功能，降低谷氨酸的毒性［16］。

(5)有利于認知和記憶能力:急性腦損傷的小鼠在上調(diào)海馬區(qū)BDNF 表達后，認知能力明顯改善［17］。

腦缺血后，早期即可以引起B(yǎng)DNF 表達增多，這種變化是神經(jīng)細胞的一種自我保護機制，通過這種機制減輕損傷程度，并促進后期神經(jīng)功能的恢復，但是這種自我保護能力是有限的。直接由靜脈給予外源性BDNF，由于BDNF 難以通過血腦屏障，未能有效發(fā)揮腦保護作用［18］。因此，用藥物增加內(nèi)源性BDNF 以發(fā)揮腦保護作用，成為研究、開發(fā)腦缺血保護藥物的途徑之一。

經(jīng)嗅覺系統(tǒng)進入腦通路可能成為中樞系統(tǒng)藥物直接作用于大腦的新途徑。前期進行的大量動物實驗為此提供了有力的證據(jù)。神經(jīng)行為學實驗證實，丁香酚的吸嗅能夠起到改善小鼠學習記憶功能的作用［5，6］，對抑郁癥模型小鼠丁香酚吸嗅可以緩解的抑郁樣行為［19］。從嗅覺的工作機制可知，丁香酚與嗅覺受體的結(jié)合是芳香分子與受體特異性結(jié)合，所產(chǎn)生的嗅覺信號通過特異性的嗅覺通路被傳送至腦的嗅覺相關區(qū)域。丁香酚本身并不直接進入腦組織，且嗅覺信號在傳遞的過程中有特異性、高敏感性、可飽和性、級聯(lián)放大等特點。所以相比于現(xiàn)在臨床常用藥物丁香酚吸嗅給藥方法安全性高、給藥方便經(jīng)濟，患者依從性好。

本實驗結(jié)果顯示丁香酚吸嗅組的BDNF 表達顯著高于模型組。證明丁香酚吸嗅用來緩解腦缺血后損傷的癥狀是可行的，可以改善缺血后的認知記憶能力等行為學指標，可能是通過上調(diào)腦內(nèi)BDNF 蛋白的表達，進而調(diào)節(jié)腦區(qū)功能，改善缺血后損傷。

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