曲昊淼 丁玲 趙姬臣 夏彥玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

梅花鹿鹿茸組織Anxa-1基因cDNA克隆及表達1)

曲昊淼 丁玲 趙姬臣 夏彥玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

從梅花鹿(Cervusnippon)鹿茸間充質(zhì)中成功克隆出包括膜聯(lián)蛋白A1(Anxa-1)基因全部編碼區(qū)的cDNA序列，并結(jié)合生物學(xué)信息方法及實時熒光定量技術(shù)對該基因的氨基酸序列及不同生長時期的表達情況進行了分析。結(jié)果表明：Anxa-1基因編碼346個氨基酸。經(jīng)生物學(xué)信息分析，該基因編碼蛋白為穩(wěn)定蛋白，不具備信號肽，相對分子質(zhì)量為38 830.4，理論等電點為6.17，一級結(jié)構(gòu)中亮氨酸占最大比例(10.4%)。同源序列比對及系統(tǒng)進化樹分析表明，梅花鹿Anxa-1氨基酸序列與藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)和水牛(Bubalusbubalis)相似性較高。實時熒光定量RT-PCR分析表明，Anxa-1基因在不同生長時期鹿茸頂端間充質(zhì)表達存在差異，生長前期的表達量高于中期與后期。

膜聯(lián)蛋白A1；鹿茸；cDNA；克??；實時熒光定量RT-PCR

We cloned the cDNA sequence including all the coding region of theAnxa-1 gene from sika deer antler mesenchymal for the first time, and used bioinformatics method and real-time RT-PCR to analyze the amino acid sequence and the expression at different phases. TheAnxa-1 gene encoded a peptide of 346 amino acid residues of which the relative molecular weight was 38 830.4. By analyzing biological information, the gene had an isoelectric point of 6.17, and did not contain a signal peptide; Leucine accounted for the largest proportion in the primary structure was 10.4%. Homologous sequence alignment and phylogenetic tree analysis indicated that theAnxa-1 mature protein of sika deer was highly similarity withPantholopshodgsonii,Ovisaries,CaprahircusandBubalusbubalis. By real-time RT-PCR, the gene expression at different phases had specificity, and the expression of theAnxa-1 gene was higher at its earlier stage than that at its intermediate and advanced stage.

鹿茸為雄鹿(馴鹿除外)未骨化而帶有茸毛的幼角，是我國一種傳統(tǒng)貴重的滋補藥材，在中醫(yī)臨床中占有重要地位，已有兩千多年的入藥歷史。鹿茸的獨特之處在于其是所有動物組織中唯一可以循環(huán)再生的組織；在生長旺期，其尖端組織細胞的分裂生長速度是腫瘤細胞生長速度的30多倍，但沒有任何癌變跡象，這吸引了眾多科學(xué)家的高度關(guān)注[1-3]，是研究哺乳動物細胞增殖、生長與分化的理想材料。鹿茸的快速增長離不開各種基因的調(diào)控，而這些基因由于其自身因素及其在不同生長階段表達量的不同，導(dǎo)致其在組織中存在不同的調(diào)控作用，因此了解基因在鹿茸組織中的調(diào)控作用有助于更深層次的了解鹿茸的生長發(fā)育機理。

膜聯(lián)蛋白A1(Anxa-1)是一種以Ca2+介導(dǎo)能與帶有負(fù)電荷的細胞膜磷脂相結(jié)合的蛋白，是Annexin超家族在脊椎動物中第一個被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的成員。Anxa-1廣泛分布于動植物的各種組織器官中，不同動植物中其氨基酸殘基組成的長度也有很大不同[4]，最早是作為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的磷脂酶A2抑制蛋白被發(fā)現(xiàn)的。Anxa-1在細胞分化、增殖及凋亡過程中起著重要作用[5]，研究表明，其在不同類型的腫瘤細胞中表達量存在顯著差異。目前GenBank中尚無鹿源Anxa-1基因序列的任何記錄。本研究根據(jù)牛、豬等物種Anxa-1基因序列設(shè)計同源引物，首次成功克隆了具有完整編碼區(qū)的Anxa-1基因的cDNA序列，并對其序列進行了生物信息學(xué)分析，通過實時熒光定量技術(shù)研究了鹿茸間充質(zhì)在不同生長時期——生長前期(小鞍子)、生長中期(二杠茸)、生長后期(三杈茸)中Anxa-1基因的表達差異，推測其在鹿茸生長發(fā)育過程中的作用，這一研究的開展可能為鹿茸的生長發(fā)育機理的研究提供很好的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取人工馴養(yǎng)的一頭健康成年東北梅花鹿(Cervusnippon)作為試驗動物。在其小鞍子茸型時采集左茸頂端組織作為前期試驗樣品，在其二杠茸型時采集右茸頂端組織作為中期試驗樣品，在其被鋸的左茸再長至三杈茸型時采集其頂端組織作為后期試驗樣品，分別截取3個時期的鹿茸頂端5 cm左右，迅速將其表面消毒，縱向剖開，按照Li等[6]所述的方法采取鹿茸頂端的間充質(zhì)組織，按每管大約100 mg分裝于凍存管中，迅速放入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鹿茸頂端間充質(zhì)組織的總RNA的提取及cDNA模板的獲取

按照TRIzol試劑的操作步驟分別提取鹿茸3個不同生長時期的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光法檢測總RNA質(zhì)量(圖1)。以提取的總RNA為模板，以O(shè)ligo-dT為引物，以M-MLVⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

圖1 鹿茸頂端間充質(zhì)組織總RNA純度檢測

1.3 Anxa-1基因cDNA克隆

參照GenBank中牛、豬、綿羊等物種的Anxa-1基因序列，設(shè)計同源引物(Forward primer：CAAAAATGGCAATGGTAT和Reverse primer：ATCAAAGGAATGTTTAGTCTC)，以中期組織cDNA為模板進行PCR擴增，利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，涂板并于37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，經(jīng)陽性克隆檢測送往華大公司進行雙向測序。

1.4 Anxa-1的生物信息學(xué)分析

采用ORF程序查找序列的開放閱讀框，用ExPASy服務(wù)器上ProtParam程序分析蛋白的理化性質(zhì)，ProScal程序分析蛋白的疏水性，使用NCBI上的BlastP程序進行蛋白保守區(qū)預(yù)測，應(yīng)用軟件SignalP3.0預(yù)測蛋白的信號肽，使用PSORT Ⅱ和TMHMM Server v.2.0對蛋白質(zhì)的亞細胞定位及跨膜蛋白分析，使用SOPMA軟件進行蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。利用軟件DNAStar和MEGA5.0進行氨基酸的多重序列比對和系統(tǒng)進化樹的繪制。

1.5 Anxa-1的實時熒光定量RT-PCR分析

分別提取鹿茸尖端不同生長時期的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。合成Anxa-1基因的特異性引物(Forward primer：GCTATCCCCATCTCCGCAG和Reverse primer：GGCTGGCTTGTAGCACACTTC)，以β-actin作為內(nèi)參基因(Forward primer：GCGTGACATCAAGGAGAAGC和Reverse primer：GGAAGGACGGCTGGAAGA)，對鹿茸不同生長時期的Anxa-1基因表達量進行定量分析。在ABI公司的7500 Real-Time PCR system上進行Real-time RT-PCR，PCR反應(yīng)體系(25.0 μL)包括：SYBR Premix EXTaqTM Ⅱ(2×)12.5 μL，正向及反向引物(10 mmol·L-1)各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，加高壓滅菌水補足體積至25.0 μL。反應(yīng)程序分為兩部分：第一部分為擴增反應(yīng)，95 ℃ 10 min，在95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s下循環(huán)40次，設(shè)定在每個循環(huán)中60 ℃ 1 min時讀取熒光值；第二部分為建立熒光PCR產(chǎn)物熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72 ℃升溫至95 ℃，持續(xù)15 s，然后降至60 ℃，持續(xù)1 min，之后緩慢升溫至95 ℃，整體反應(yīng)結(jié)束。使用軟件ABI 7500 Software Version 2.3分析Anxa-1基因相對β-actin基因的的差異表達Ct值，通過普遍使用的2-ΔΔCt法[7]來計算分析基因在不同時期的相對表達量，其中，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)標(biāo)基因)；ΔΔCt=ΔCt(試驗組)-ΔCt(對照組)；2-ΔΔCt表示試驗組目的基因的表達相對于對照組變化的倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Anxa-1基因cDNA的獲得

Anxa-1基因的陽性克隆檢測獲得一條1 000 bp左右的插入片段(圖2)，后經(jīng)測序公司反饋回的雙向測序結(jié)果經(jīng)DNAStar拼接得到1 059 bp片段，與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)進一步與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，證實為Anxa-1基因的cDNA序列(圖3)。

M.DL2000 Marker；1.陽性菌落PCR產(chǎn)物。

圖3 Anxa-1基因的cDNA序列和推定的氨基酸序列

2.2 Anxa-1基因的序列

ORF程序顯示：Anxa-1基因的開放閱讀框為1 041 bp，編碼346個氨基酸；通過NCBI的BlastP在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫對Anxa-1基因進行蛋白保守區(qū)預(yù)測表明，與此基因匹配的蛋白保守區(qū)共有4個Annexin結(jié)構(gòu)域，其匹配區(qū)段分別為從第47～111個氨基酸、第118～183個氨基酸、第202～267個氨基酸和第277～342個氨基酸(圖4)；ProtParam軟件預(yù)測Anxa-1基因編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為38 830.4，理論等電點為6.17，整個氨基酸組成中亮氨酸占最大比例(10.4%)，其次為賴氨酸(9.8%)，不穩(wěn)定系數(shù)為39.26，屬于穩(wěn)定蛋白；使用SignalP3.0軟件顯示該基因編碼的蛋白質(zhì)不具備信號肽；利用TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測到其跨膜蛋白的數(shù)目為0，結(jié)果預(yù)期數(shù)值為0.00019，分值小于18，它不可能是一個跨膜蛋白；使用PSORT Ⅱ軟件進行亞細胞定位分析表明，56.5%的可能性在細胞質(zhì)中。

圖4 推導(dǎo)的Anxa-1氨基酸保守區(qū)查找結(jié)果

2.3 不同物種間Anxa-1的同源性

將梅花鹿與GenBank選出的8種動物的Anxa-1氨基酸全序列進行BlastP對比，發(fā)現(xiàn)其與藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)、水牛(Bubalusbubalis)具有很高的相似性，與小鼠(Musmusculus)和豬(Susscrofa)次之，而與原雞(Gallusgallus)和人(Homosapiens)的Anxa-1序列相似性最低。

應(yīng)用軟件DNAStar和MEGA5.0對9個物種的Anxa-1氨基酸序列進行多重序列比對和系統(tǒng)進化樹的繪制(圖5、圖6)，結(jié)果表明，不同物種的Anxa-1氨基酸表現(xiàn)出較高的同源性，說明Anxa-1基因作為功能基因在進化中具有較高的保守性。從進化樹可以看出，在該基因座位上梅花鹿與藏羚羊、綿羊、山羊和水牛在進化關(guān)系上較近，與原雞和人親緣關(guān)系較遠，分析結(jié)果與各種物種在傳統(tǒng)分類學(xué)上的地位一致。

1.梅花鹿(Cervusnippon)；2.綿羊(Ovisaries)；3.藏羚羊(Pantholopshodgsonii)；4.山羊(Caprahircus)；5.人類(Homosapiens)；6.豬(Susscrofa)；7.小鼠(Musmusculus)；8.水牛(Bubalusbubalis)；9.原雞(Gallusgallus)。

圖5 梅花鹿與其他動物Anxa-1氨基酸的多重序列對比

圖6 動物Anxa-1系統(tǒng)進化樹

2.4 Anxa-1基因的實時熒光定量RT-PCR

實時熒光定量RT-PCR的結(jié)果顯示，Anxa-1基因在鹿茸生長前期表達量是中期的(1.84±0.34)倍，后期的表達量是中期的(1.12±0.26)倍，可見Anxa-1基因在鹿茸尖端表達的規(guī)律是前期>后期>中期(表1)。

表1 鹿茸頂端間充質(zhì)組織前期、后期與中期Anxa-1基因表達的差異

生長期Anxa-1平均Ct值β-actin平均Ct值ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt前期22.34±0.0323.04±0.19-(0.70±0.11)-(0.88±0.21)1.84±0.34中期(對照組)23.41±0.0323.23±0.110.18±0.0601.00后期22.68±0.2222.67±0.100.02±0.14-(0.16±0.24)1.12±0.26

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3 結(jié)論與討論

Anxa-1基因cDNA中開放閱讀框1 041 bp編碼346個氨基酸殘基，組成分子量為38 830.4的Anxa-1蛋白，其中心結(jié)構(gòu)域由4個重復(fù)序列組成，每個重復(fù)序列含有5個α螺旋。4個重復(fù)序列緊密壓縮在一起，形成一個輕度彎曲的盤狀結(jié)構(gòu)，具有與鈣離子及磷脂結(jié)合的位點。從其生物學(xué)信息分析中可以看出，其編碼蛋白質(zhì)沒有具備信號肽的可能，且不是跨膜蛋白，是高度保守的穩(wěn)定蛋白。利用MEGA軟件進行物種間遺傳距離計算得出與原雞的遺傳距離最遠，與藏羚羊遺傳距離最近，其分析結(jié)果與物種的傳統(tǒng)分類學(xué)地位十分一致，且符合進化關(guān)系。

近年來的研究表明，Anxa-1基因可能是作為一種腫瘤抑制基因或某些腫瘤細胞/組織特定類型的腫瘤啟動子。Srisomsap等[8]研究證明Anxa-1主要具有抑癌功能，其在腫瘤形成前呈高表達，其后隨不同程度而減弱。也有研究表明其可抑制由表皮生長因子(EGF)引起的肝細胞增殖[9]。但有研究發(fā)現(xiàn)Anxa-1也可促進細胞增殖，在肝細胞中磷酸化的Anxa-1可作為一種誘導(dǎo)信號刺激細胞信使前列腺素E2的釋放，從而引發(fā)一系列的細胞增殖反應(yīng)[10]。目前就Anxa-1基因在細胞增殖中的作用還存在疑議，有可能是其在不同的組織細胞中發(fā)揮不一樣的作用導(dǎo)致。本研究發(fā)現(xiàn)，Anxa-1基因在鹿茸生長前期表達量高于生長中期、后期的表達量，由此可以推測其在生長前期抑制了鹿茸細胞的增殖，而到了中期和后期表達下調(diào)，鹿茸得以進入快速增長期。

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Cloning and Expression Analysis ofAnxa-1 Gene cDNA from Sika Deer Antler Tissue

Qu Haomiao, Ding Ling, Zhao Jichen, Xia Yanling(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：99-103.

Annexin A1; Antler; cDNA; Clone; Real-time RT-PCR

曲昊淼，男，1988年10月生，東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，碩士研究生。E-mail：510008084@qq.com。

夏彥玲，東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，副教授。E-mail：xiayanling1974@163.com。

2014年8月4日。

S825.2

1)中國博士后基金(20110491124)。

責(zé)任編輯：程 紅。