孫雪 李明會(huì) 張慶 粟楊靜

(西南林業(yè)大學(xué)，昆明，650224) (云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西南林業(yè)大學(xué)))

澤漆(Euphorbia helioscopia)又名五朵云、五燈草、五風(fēng)草等，屬大戟科，全國(guó)分布廣泛［1］，性微寒，味苦，有毒［2］，在民間多為全草入藥，有利尿消腫、化痰、散結(jié)、殺蟲(chóng)止癢之功效［3］。因澤漆具有毒性，其良好的殺鼠活性為植物源滅鼠藥增添了潛力和開(kāi)發(fā)價(jià)值，但目前未見(jiàn)關(guān)于澤漆中毒后，中毒對(duì)象的主要生理指標(biāo)變化與臟器損傷情況的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究對(duì)澤漆乙酸乙酯萃取物的GHS 毒性進(jìn)行了別類(lèi)劃分，并對(duì)其LD50范圍進(jìn)行初步評(píng)估，以點(diǎn)斜法測(cè)定其LD50的具體數(shù)值，判斷其滅鼠活性大小。試驗(yàn)過(guò)程中，觀察、記錄澤漆乙酸乙酯萃取物對(duì)小鼠的毒副作用。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

澤漆全草采于昆明市，粉碎，備用。試驗(yàn)用鼠為昆明小鼠遠(yuǎn)交系(KM 小鼠封閉群)，購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量18～22 g。經(jīng)過(guò)7 d 開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室的適應(yīng)性飼養(yǎng)，喂食從昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)的標(biāo)準(zhǔn)飼料與自來(lái)水。選擇體質(zhì)量不超過(guò)全部小鼠的平均體質(zhì)量20%的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)小鼠以3%～5%苦味酸標(biāo)記。

1．2 試驗(yàn)方法

澤漆萃取物制備:澤漆全草經(jīng)45 ℃烘干、粉碎、過(guò)40 目篩后以70%乙醇45 ℃恒溫水浴提取。提取液以50 ℃恒溫減壓濃縮，回收溶劑至稠膏狀。濃縮的提取物用2 倍體積的乙酸乙酯萃取4 次，萃取液再以50 ℃恒溫減壓濃縮，回收溶劑至稠膏狀，即得到澤漆的乙酸乙酯萃取物。

澤漆乙酸乙酯萃取物毒性GHS 類(lèi)別劃分:根據(jù)《化學(xué)品急性經(jīng)口毒性固定劑量試驗(yàn)方法》對(duì)澤漆乙酸乙酯萃取物的LD50范圍進(jìn)行評(píng)估。

預(yù)試驗(yàn):在GHS 毒性類(lèi)別的判斷試驗(yàn)中，得出LD50的預(yù)計(jì)取值范圍是170 ～450 mg·kg-1，屬于危險(xiǎn)級(jí)別的有毒物。

正式試驗(yàn):根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，總選取60 只KM小鼠，其中雌、雄小鼠各30 只［4］。用點(diǎn)斜法測(cè)定LD50，以0．8 的等比級(jí)數(shù)設(shè)置5 個(gè)灌胃劑量組，分別是179．20、224．00、280．00、350．00、437．50 mg·kg-1，每個(gè)劑量組灌胃10 只小鼠，雌、雄鼠各5 只，每5 只中選取中毒表現(xiàn)中等的小鼠作為解剖用，每只小鼠一次性灌胃試液體積0．2 mL。同時(shí)，另選雌、雄小鼠各5 只組成1 個(gè)空白組，一次性灌胃0．2 mL 蒸餾水。各組的雌、雄小鼠均分籠飼養(yǎng)。

1．3 數(shù)據(jù)處理

澤漆乙酸乙酯萃取物L(fēng)D50的計(jì)算采用點(diǎn)斜法［5］200-210。

回歸系數(shù)b=(ˉyn-ˉye)/(iR)。

截距a=5-blogLD50。

回歸方程y=a+bx。

死亡率為r 的致死劑量］。

logLDr的標(biāo)準(zhǔn)誤。

logLDr的平均置信區(qū)間

式中:p 是死亡率;y 是死亡率對(duì)應(yīng)的概率單位;ˉyn是高半組y 值均數(shù);ˉye是低半組y 值均數(shù);R 是n 與e間相差的組數(shù)距;k 為分組組數(shù);i 是相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值差;n 是每組動(dòng)物數(shù)。

灌胃給藥后對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)14 d 的觀察，其中，每隔12 h 觀察記錄一次小鼠的行為與死亡數(shù)。小鼠校正死亡率=((試驗(yàn)組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-空白組小鼠死亡率))。

2 結(jié)果與分析

2．1 乙酸乙酯萃取物灌胃LD50

根據(jù)GHS 類(lèi)別評(píng)價(jià)結(jié)果，澤漆乙酸乙酯萃取物的GHS 毒性類(lèi)別為3 類(lèi)，對(duì)其進(jìn)行小鼠灌胃LD50測(cè)定。同時(shí)，根據(jù)點(diǎn)斜法相關(guān)公式，可以計(jì)算任意死亡率(r)下乙酸乙酯萃取物的灌胃劑量。以10 只小鼠為一組的試驗(yàn)出現(xiàn)死亡個(gè)體的最低死亡率是10%。因此，將10%死亡率時(shí)乙酸乙酯萃取物的劑量(LD10)作為最低致死劑量的估計(jì)值。試驗(yàn)中，高半組y 值均值ˉyn=5．77，低半組y 值均值ˉye=4．16，高、低半組相差的組數(shù)距R=2，分組組數(shù)k=5，相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值差i=0．097，每組動(dòng)物數(shù)n=10。其它相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。測(cè)定結(jié)果表明，LD50的致死劑量為314．80 mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)誤為0．027 0，95%置信區(qū)間為(314．80±38．29)mg·kg-1，99%置信區(qū)間為(314．80±50．20)mg·kg-1;LD10的致死劑量為220．53 mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)誤為0．035 9，95%置信區(qū)間為(220．53±35．61)mg·kg-1，99%置信區(qū)間為(220．53±46．69)mg·kg-1。

表1 澤漆乙酸乙酯萃取物對(duì)小鼠灌胃LD50測(cè)定的數(shù)據(jù)

2．2 KM 小鼠日食量與體質(zhì)量

采用小鼠個(gè)體的平均日食量、試驗(yàn)期間的平均體質(zhì)量作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)灌胃組和空白組小鼠間食量與體質(zhì)量進(jìn)行差異性分析。LD50測(cè)定試驗(yàn)中，灌胃280．00 mg·kg-1以上劑量的試驗(yàn)組中，雌、雄小鼠的平均日食量與空白組的差異顯著。224 mg·kg-1試驗(yàn)組中雌鼠的平均日食量與空白組差異顯著。灌胃280 mg·kg-1以上劑量的試驗(yàn)組中，雌、雄小鼠的平均體質(zhì)量與空白組差異顯著或極顯著(表2)。

表2 KM 小鼠LD50測(cè)定試驗(yàn)組與空白組平均日食量、平均體質(zhì)量的差異性

2．3 KM 小鼠臟器質(zhì)量

根據(jù)LD50可以看出，350．00 mg·kg-1劑量及以上的試驗(yàn)組雌、雄小鼠的全部臟器系數(shù)均與空白組差異顯著。同時(shí)，肝臟、脾臟和肺臟的臟器系數(shù)在低于350．00 mg·kg-1的劑量組中也有表現(xiàn)顯著差異(表3)。

2．4 KM 小鼠中毒表現(xiàn)

GHS 試驗(yàn)中小鼠灌胃50 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物沒(méi)有明顯的毒性反應(yīng)，灌胃乙酸乙酯萃取物300 mg·kg-1時(shí)，表現(xiàn)出明顯的偏癱、體質(zhì)量和食量下降、伏地不動(dòng)、行走搖擺、四肢抽搐、經(jīng)?！班袜汀钡拇蜞?或咳嗽)等，并出現(xiàn)死亡。

對(duì)GHS 正式試驗(yàn)的全部小鼠進(jìn)行解剖觀察時(shí)發(fā)現(xiàn):灌胃50 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠脾臟體積偏大，肝臟顏色較暗。但是，對(duì)預(yù)試驗(yàn)中灌胃300 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠解剖發(fā)現(xiàn)，其胃部脹大且胃壁布滿(mǎn)血絲，胃腸內(nèi)容物為暗紅色黏稠液體，有明顯的腐臭味。肝臟有明顯的黑斑，肺臟多處出現(xiàn)暗紅色斑點(diǎn)，腎臟表皮容易被剝落，其余沒(méi)有肉眼可視病變。

表3 KM 小鼠LD50測(cè)定試驗(yàn)組與空白組臟器質(zhì)量系數(shù)的差異性

LD50測(cè)定試驗(yàn)的小鼠除了表現(xiàn)出與GHS 類(lèi)別評(píng)價(jià)試驗(yàn)中灌胃300 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠相同的癥狀外，在350．00 mg·kg-1與437．50 mg·kg-1劑量組中還發(fā)現(xiàn)小鼠排泄物的酸臭味比低劑量組及空白組明顯，且小鼠在死亡前出現(xiàn)明顯的食量、體質(zhì)量與體溫下降。同時(shí)，在最高劑量組中小鼠的肺臟和肝臟病變更明顯，胃腸道變成暗紅色，心臟局部變黑或出現(xiàn)血管突出明顯。

3 結(jié)論與討論

在乙酸乙酯萃取物L(fēng)D50的測(cè)定試驗(yàn)中，共死亡了26 只小鼠且并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雌鼠比雄鼠表現(xiàn)出更明顯的中毒癥狀，或是有更高的死亡率、更快的死亡速度。澤漆乙酸乙酯萃取物的LD50為314．80 mg·kg-1，95%置信區(qū)間為(314．80±38．29)mg·kg-1。

試驗(yàn)小鼠的中毒癥狀與解剖結(jié)果與生物堿、黃酮類(lèi)物質(zhì)中毒癥狀有較大的相似性。烏頭類(lèi)生物堿可以導(dǎo)致呼吸困難，甚至衰竭，可使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)先興奮后麻痹，然后喪失知覺(jué)，常表現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙;山黧豆(Lathyrus sativus)生物堿可使中毒動(dòng)物表現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力衰弱，身軀麻痹，呼吸困難等，同時(shí)引起肝、脾、腎腫大，心室充滿(mǎn)暗紅色血液，外觀變暗等病變［5］200-210。結(jié)合澤漆成分大類(lèi)定性結(jié)果，初步估計(jì)澤漆的主要有毒成分可能與生物堿或黃酮類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。

試驗(yàn)結(jié)果把澤漆乙酸乙酯萃取物GHS 類(lèi)別劃定為3 類(lèi)，同時(shí)LD50的計(jì)算結(jié)果也都顯示澤漆乙酸乙酯萃取物有較好的殺鼠活性。

試驗(yàn)動(dòng)物的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，例如:體質(zhì)量、臟器質(zhì)量系數(shù)、血常規(guī)等，通常被用于試驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)、藥品動(dòng)物試驗(yàn)、疾病動(dòng)物模型研究的主要參考指標(biāo)［6］，飼料配方的變化、取食方式、試驗(yàn)環(huán)境不同等原因都有可能影響不同批次的KM 小鼠的生物學(xué)指標(biāo)［7-9］，因此，KM 小鼠的相關(guān)試驗(yàn)更多采用在同等條件下，以同批次試驗(yàn)動(dòng)物設(shè)置空白對(duì)照組，通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)組與空白組的差異，說(shuō)明試驗(yàn)組動(dòng)物的變化。本次試驗(yàn)采用動(dòng)物生理指標(biāo)中的食量、體質(zhì)量、臟器質(zhì)量系數(shù)對(duì)小鼠灌胃澤漆乙酸乙酯萃取物后的生理變化進(jìn)行了探索。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物不僅能夠造成小鼠多器官肉眼可視病變，還能引起食量、體質(zhì)量、臟器質(zhì)量系數(shù)的明顯變化。但是，在試驗(yàn)當(dāng)中出現(xiàn)了小鼠體質(zhì)量的明顯下降，因此，臟器質(zhì)量系數(shù)的顯著變化有可能是萃取物毒性引起的，也有可能是體質(zhì)量顯著下降引起的假陽(yáng)性結(jié)果。其中的變化機(jī)制與實(shí)質(zhì)影響還需要進(jìn)一步開(kāi)展生化指標(biāo)檢驗(yàn)、組織檢驗(yàn)等研究加以解釋。同時(shí)，澤漆乙酸乙酯萃取物對(duì)小鼠其他生理生化方面的具體影響也還有待更廣泛深入的研究。

綜上所述，澤漆乙酸乙酯萃取物具有良好的殺鼠活性并具有較好地開(kāi)發(fā)為植物源滅鼠藥的潛力，有進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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