高雪 曹欽政 黃鳳杰 賈桂霞

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (中國科學(xué)院植物研究所) (花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)))

亞洲百合與東方百合遠(yuǎn)緣雜交親和性1)

高雪 曹欽政 黃鳳杰 賈桂霞

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (中國科學(xué)院植物研究所) (花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)))

為得到花色豐富、帶有芳香氣味、抗性強(qiáng)的OA或AO(O為東方百合雜種系，A為亞洲百合雜種系)型優(yōu)勢雜種，采用常規(guī)雜交和切割柱頭的方法進(jìn)行雜交，結(jié)果AO型的22個組合，僅有亞洲百合‘Pollyanna’×東方百合‘Sambuca’這一組合得到了4個膨大的蒴果和40粒有胚種子，結(jié)實(shí)率為0.27%；85個LA(LA為Longiflorum hybrids×Asiatic hybrids的雜交后代)×O型組合均未得到完全膨大的果實(shí)和有胚種子；而21個OA型組合，有7個組合得到了膨大的蒴果及有胚種子。采用切割柱頭的方法也未提高結(jié)實(shí)率，說明其沒能有效克服其遠(yuǎn)緣雜交的障礙。通過花粉管熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)，亞洲百合和東方百合花粉幾乎均能在母本的柱頭上萌發(fā)，并沿著花柱道伸長生長，最終達(dá)到子房進(jìn)入胚珠，說明AO型或OA型遠(yuǎn)緣雜交的受精障礙主要為受精后障礙。

亞洲百合；東方百合；遠(yuǎn)緣雜交親和性；花粉管

百合(Lilium)是百合科(Liliaceae)百合屬植物的總稱，其花大色艷，姿態(tài)優(yōu)美，清雅脫俗，既能做切花、盆花，又能用于園林綠化；既能觀賞，又能食用和藥用，深受人們的喜愛和歡迎。百合分布較廣，主要分布在中國、日本、加拿大、美國和歐洲的溫帶地區(qū)。中國是百合屬植物的自然分布中心，也是世界百合的起源中心[1]340。

20世紀(jì)以來，隨著人工育成的百合栽培品種日益增多，英國皇家園藝學(xué)會(RHS)和北美百合學(xué)會(NALS)按照百合栽培品種和其原始親緣種與雜種的遺傳衍生關(guān)系分為9大類：亞洲百合雜種系(Asiatic hybrids)；歐洲百合雜種系(Martagon hybrids)；純白百合雜種系(Candidum hybrids)；美洲百合雜種系(American hybrids)；麝香百合雜種系(Longiflorum hybrids)；喇叭形雜種系和奧列蓮雜種系(Trumpet hybrids and Aurelian hybrids)；東方百合雜種系(Oriental hybrids)；其他雜種系(Miscellaneus hybrids)；百合原種系(Lily Species)[2]。其中亞洲百合花色豐富多樣、花朵秀麗、植株挺拔，具有很高的觀賞價值，但無香味；從抗病性而言，多數(shù)品種抗鐮刀菌引起的枯萎病，但易感灰霉病[1，3]。東方百合花朵碩大，花型美麗，具濃郁的芳香氣味，但花色較為單一；從抗性上而言，對鱗莖腐爛病敏感，但具有較強(qiáng)的灰霉病抗性[3-4]。若能綜合亞洲百合和東方百合優(yōu)良性狀，得出花大色艷且有香味、抗病性強(qiáng)的雜種，將會有良好的市場前景，van Tuyl[5]就認(rèn)為OA雜種(Oriental×Asiatic)是最有前景的雜交組合。但二者不僅外觀性狀相差很大，而且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，雜交很難取得成功。二者間進(jìn)行雜交成功的報道見于Okazaki et al[6]、Asano et al.[7]的論文，Chi[8]通過胚培養(yǎng)獲得OA雜交種。目前，荷蘭育種專家已經(jīng)培育出OA雜交百合新品種[9]，而AO型雜交報道較少。

本研究以亞洲百合6個品種、LA雜種系百合24個品種和東方百合20個品種為試驗(yàn)材料進(jìn)行雜種系間的正、反雜交，研究不同組合的雜交親和性，并采用常規(guī)授粉和切割柱頭授粉方法以期提高雜交結(jié)實(shí)率；同時運(yùn)用熒光顯微技術(shù)對遠(yuǎn)緣雜交花粉萌發(fā)及花粉管生長情況進(jìn)行觀察，以期初步了解遠(yuǎn)緣雜交的障礙機(jī)制，為今后百合雜交育種工作提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

本試驗(yàn)所用的百合栽培品種均于荷蘭進(jìn)口，栽培在國家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué))小湯山百合資源圃。雜交親本共包括亞洲百合雜種系(A)6個品種、LA雜種系百合(LA，為Longiflorum hybrids×Asiatic hybrids的雜交后代)23個品種以及東方百合雜種系(O)20個品種。其主要性狀見表1。

表1 雜交父、母本品種及其性狀

雜交：遠(yuǎn)緣雜交試驗(yàn)于2012年7—8月份在大田中進(jìn)行，授粉時環(huán)境溫度為28～32 ℃，空氣相對濕度約為40%。在親本花蕾完全顯色，開花前1～2 d去雄套袋，開花當(dāng)天授粉。雜交組合授以目標(biāo)父本的花粉，花期不能相遇的組合授以預(yù)先低溫干燥保存的花粉?；ǚ墼谑诜矍熬M(jìn)行花粉活力測定，花粉萌發(fā)液為蔗糖100 g·L-1+H3BO325 mg·L-1+CaCl230 mg·L-1[10]。選用花粉萌發(fā)率在30%以上的花粉進(jìn)行雜交授粉。對每個雜交組合均采用以下兩種方法雜交：常規(guī)柱頭授粉，在開花當(dāng)天11：00前，將待選花粉涂抹到母本的柱頭上，并用錫箔紙包裹。切割柱頭授粉，選取開花前一天包裹好柱頭的花朵作為母本，在花柱基部0.5 cm處割斷并縱切0.3 cm，在切割處涂抹花粉萌發(fā)液再給予授粉[11-13]。每個雜交組合授粉15朵，雜交后掛牌，并于7 d后除去錫箔紙，做好記錄。

雜交親和性觀察：在授粉后統(tǒng)計子房膨大的情況，此后不斷觀察記錄。若果實(shí)不再增大，顏色開始變黃，即將萎縮時進(jìn)行胚拯救。若果實(shí)可以成熟則及時收獲。以結(jié)實(shí)率和有胚種子數(shù)作為判斷雜交親和性的標(biāo)準(zhǔn)。其中，結(jié)實(shí)率=(成熟果實(shí)數(shù)/授粉花朵數(shù))×100%。

花粉管的熒光顯微觀察：分別取授粉后1、12、24、36、48、56、72 h后的柱頭和子房放入卡諾固定液(V(乙醇)∶V(醋酸)=3∶1)進(jìn)行固定，并在4 ℃?zhèn)溆?。壓片前，分別用70%和50%的乙醇沖洗柱頭和子房，再用蒸餾水進(jìn)行洗脫。接著用8 mol·L-1的NaOH溶液浸泡10～30 min軟化。最后用0.1%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色，壓片后用Leica顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)緣雜交親和性的評價

2.1.1 以亞洲百合、LA雜種系百合為母本，東方百合為父本的雜交親和性

分別采用常規(guī)授粉和切割柱頭的方法進(jìn)行雜交，其中以亞洲百合為母本，選配了22個組合進(jìn)行雜交，結(jié)果僅有‘Pollyanna’בSambuca’組合得到了4個蒴果(圖1)及40個有胚的種子，結(jié)實(shí)率達(dá)到27%；而其余組合均敗育(圖2)。以LA雜種系百合為母本，共選配了85個組合，結(jié)果所有配組均未得到完全膨大的果實(shí)，個別組合雖有膨大現(xiàn)象，但卻未得到有胚種子。雜交的大部分組合在授粉后30 d開始出現(xiàn)黃化、萎蔫的情況，并逐漸皺縮，剝開果實(shí)并未發(fā)現(xiàn)有胚種子。雖采用切割柱頭方法進(jìn)行雜交，但是結(jié)實(shí)率仍為0，說明切割柱頭并未有效提高雜交結(jié)實(shí)率。

圖1 ‘Pollyanna’בSambuca’雜交所得果實(shí)的生長情況

圖2 以亞洲百合為母本、東方百合為父本的雜交敗育現(xiàn)象

2.1.2 以東方百合為母本、亞洲百合為父本的雜交親和性

同樣分別采用常規(guī)授粉和切割柱頭的方法進(jìn)行雜交，雜交結(jié)實(shí)率和有胚種子數(shù)見表2。從表2可以看出，以東方百合為母本的雜交親和性要大于以亞洲百合為母本的雜交親和性。共雜交了21個組合，其中7個組合得到了有胚種子，分別為‘Corvara’בRenoir’、‘Tiber’בRenoir’、‘Tiber’בVal di Sole’、‘Acapulco’בPollyanna’、‘Acapulco’בRenoir’、‘Constanta’בNew wave’、‘Constanta’בPollyanna’，僅有一個組合(‘Tiber’בVal di Sole’)通過切割柱頭的授粉方式得到了雜交種，說明切割柱頭的授粉方式在獲得

OA雜種方面的作用也并不明顯。雖然有得到膨大的果實(shí)，但是結(jié)實(shí)率均低于50%，7個組合得到的蒴果內(nèi)有胚種子均很少，而且不同組合間存在明顯的差別。其中‘Tiber’בRenoir’得到有胚種子的數(shù)量最多，而且‘Tiber’作為母本與兩種亞洲百合品種雜交得到的果實(shí)數(shù)以及有胚種子數(shù)均較高，‘Acapulco’、‘Constanta’作為母本也分別與兩種亞洲百合雜交得到了果實(shí)及有胚種子，說明在以東方百合為母本的雜交中，‘Tiber’、‘Acapulco’、‘Constanta’都有良好的表現(xiàn)，均適宜作為母本應(yīng)用。亞洲百合中‘Renoir’作為父本與3種東方百合都獲得了雜種胚，‘Pollyanna’作為父本與兩種東方百合獲得了有胚種子，說明‘Renoir’、‘Pollyanna’在實(shí)際的雜交應(yīng)用中，適合作為父本使用。

2.2 不同雜交組合授粉后花粉萌發(fā)及花粉管生長情況

由雜交結(jié)果得到了以東方百合為母本、亞洲百合為父本雜交后膨大的果實(shí)和有胚種子，選取其中雜交的5個組合進(jìn)行花粉管伸長生長的觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所選的5個組合花粉管生長情況類似，表現(xiàn)為在雜交授粉后1 h無花粉粒萌發(fā)，到12 h后聚集在柱頭表面萌發(fā)，伸長并不明顯，授粉后24 h后，花粉管穿過柱頭頂部進(jìn)入花柱；授粉36 h后達(dá)到花柱1/2位置，60 h后花粉管穿過花柱基部進(jìn)入子房；72 h后進(jìn)入胚珠。其中，僅有‘Corvara’בNew wave’這個組合授粉后12 h花粉開始在柱頭大量萌發(fā)(圖3A)，到24 h花粉管穿過花柱頭往下伸長生長；授粉36 h后達(dá)到花柱1/2位置，此時胼胝質(zhì)反應(yīng)變得異常激烈，花粉管卷曲回折(圖3B)；最終在授粉144 h后花粉管到達(dá)子房(圖3C)。

A.12 h花粉大量萌發(fā);B.36 h花粉管出現(xiàn)纏繞卷曲;C.144 h花粉管進(jìn)入胚珠。

而沒有得到膨大果實(shí)和有胚種子AO和LA×O雜交組合也出現(xiàn)類似的情況。選取雜交5個AO組合和5個LA×O的組合進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，在授粉12 h后花粉基本沒有萌發(fā)(圖4A)，24 h后萌發(fā)數(shù)量增多，但仍舊停留在柱頭頂端的位置，并未深入花柱內(nèi)部；36 h后花粉管開始深入花柱內(nèi)部，并且生長到了一定的長度，進(jìn)入中央花柱道(圖4B)，然后花粉管慢慢生長伸長最終在授粉72～168 h到達(dá)子房并進(jìn)入胚珠(圖4C)。僅有LA×O型雜交組合‘Orange Tycoon’בMentezuma’的花粉管生長情況不佳，只有幾條花粉管向下生長，花粉管沒有到達(dá)子房進(jìn)入胚珠，而其他組合均能到達(dá)子房進(jìn)入胚珠。

總之，無論是亞洲百合還是東方百合的花粉均能在母本的柱頭上萌發(fā)，花粉管也能進(jìn)入柱頭，雖然有一個組合由于花粉管太短沒能進(jìn)入子房到胚珠，但是其余組合的花粉管可以穿過花柱最終到達(dá)子房進(jìn)入胚珠，說明AO或OA型遠(yuǎn)緣雜交不親和的原因主要為受精后障礙。

A.12 h花粉部分萌發(fā);B.36 h花粉管沿花柱生長;C.花粉管進(jìn)入胚珠。

3 討論

遠(yuǎn)緣雜交是百合新品種選育和種質(zhì)創(chuàng)新的主要途徑之一，但是遠(yuǎn)緣雜交不親和給育種工作帶來了一定的困難[14]。百合三倍體通常雄性不育，但可以作為母本雜交[15]。Zhou et al.[16]觀察到在百合3X×2X/4X的雜交種，當(dāng)胚乳具有5個或5個以上相同基因組時，胚乳發(fā)育較好，雜交也容易成功。本試驗(yàn)嘗試選擇三倍體LA雜種系為母本與東方百合進(jìn)行雜交，結(jié)果在85個LA×O組合中均未得到成熟的果實(shí)和雜交種子，說明AO型雜交確實(shí)具有一定的困難。

除了常規(guī)的雜交方法，育種家們曾嘗試多種授粉方式以提高雜交結(jié)實(shí)率。目前，切割柱頭的方法是克服百合受精前障礙的最佳方法[11，14，17]，但其受雜交組合親本的影響較大，不同親本組合促進(jìn)效果差異較大，切割柱頭授粉對以花柱較長的東方百合作母本的雜交組合結(jié)實(shí)率有促進(jìn)作用，而對以花柱較短的亞洲百合作母本的雜交組合則沒有明顯促進(jìn)作用，甚至產(chǎn)生抑制作用[12]。本研究中，切割柱頭的方法也未能有效提高遠(yuǎn)緣雜交的結(jié)實(shí)率。

用花粉管熒光觀察技術(shù)能夠直接判斷高等植物自交與異交過程中花粉管的生長情況，對研究花粉管生長特性及雜交不親和表達(dá)部位具有重要意義。熒光顯微觀察法簡單方便快速有效，因此，國內(nèi)外學(xué)者普遍運(yùn)用這種方法研究果樹、花卉等農(nóng)作物雜交過程中花粉管生長情況[18-20]。Asano[21]以麝香百合為母本雜交授粉,發(fā)現(xiàn)花粉管在麝香百合花柱里生長受到了抑制,并且花粉管先端畸形膨脹，初步分析了百合雜交不親和的機(jī)理。本試驗(yàn)研究表明，東方百合和亞洲百合的花粉均能在母本的柱頭上萌發(fā)，并伸長生長，大部分組合的花粉管均能穿過花柱達(dá)到子房并進(jìn)入胚珠，說明AO型或OA型遠(yuǎn)緣雜交障礙主要為受精后障礙，如受精后幼胚不發(fā)育或發(fā)育不正常，以及雜交種子的幼胚、胚乳和子房組織之間缺乏協(xié)調(diào)性，胚乳不能為雜種胚提供正常生長所需的營養(yǎng)，影響了雜種胚的發(fā)育[1]159-160。田忠平等[22]用母本柱頭噴施KCL后授粉并對獲得的種子進(jìn)行胚拯救，使亞洲百合與東方百合3個雜交組成功獲得雜種苗，對獲得AO型有一定積極意義。今后可以嘗試多種授粉方式結(jié)合的方法來提高遠(yuǎn)緣雜交的結(jié)實(shí)率[23-24]，并對獲得的種子進(jìn)行幼胚拯救以克服遠(yuǎn)緣雜交受精后障礙[5，25]。

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Compatibility for Lily Distant Hybridization between Asiatic Hybrids and Oriental Hybrids

Gao Xue, Cao Qinzheng(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Huang Fengjie(Institute of Botany, Chinese Academy of Science); Jia Guixia(Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding, Beijing Forestry University)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：1-5.

An experiment was conducted to take hybridization to get advantaged AO or OA hybrids (A: Asiatic hybrids; O: Oriental hybrids) by normal pollination technique and cut-style pollination technique. In the experiment, with Asiatic hybrids as female parent, only one combination ‘Pollyanna’בSambuca’ among 22 combinations obtained fruits and embryos. While the number of swelling capsule and the rate of embryos reached 4 and 0.27%, respectively. With LA(LA: Longiflorum hybrids×Asiatic hybrids) hybrids as female parent, there was no fruit. However, with Oriental hybrids as female parent, 7 combinations obtained fruits and embryos. The method of cut-style pollination technique could not improve the seed rate, and failed to effectively overcome obstacles distant hybridization. The pollen germination and pollen tube growth were observed after pollination by fluorescence. The pollens of both Asiatic hybrids and Oriental hybrids could germinate on the stigma, and finally get into the ovule. Therefore, there was the hybridization barriers mainly after fertilization.

Asiatic hybrids; Oriental hybrids; Compatibility of distant hybridization; Pollen tube

高雪，女，1990年12月生，北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:496465679@qq.com。

賈桂霞，花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))、國家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué))、城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))、北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，教授。E-mail:gxjia@bjfu.edu.en。

2014年8月22日。

Q321+.3；Q949.71+8.23

1)林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201204609)、北京市園林綠化局計劃項(xiàng)目(YLHH201400103)。

責(zé)任編輯：任 俐。