劉 菲，李 明，盛明明，閻雪瑩

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

乙醇注入法制備木犀草素脂質(zhì)體

劉 菲，李 明，盛明明，閻雪瑩

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

探討乙醇注入法制備木犀草素脂質(zhì)體的制備工藝.采用乙醇注入法制備木犀草素脂質(zhì)體，微柱離心和HPLC法測定包封率，激光粒度儀測定粒徑.運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)優(yōu)選最佳處方為：磷脂600 mg，藥脂比1∶7，類酯比8∶1，有機(jī)相水相比1∶1，包封率79.3%，形態(tài)，穩(wěn)定性良好.注入法制備木犀草素脂質(zhì)體工藝簡單，制得劑型穩(wěn)定，方法可行.

木犀草素；脂質(zhì)體；乙醇注入法；正交實(shí)驗(yàn)

木犀草素為一種黃酮類化合物，現(xiàn)多從植物白毛夏枯草，青蘭中提取[1].近年來，其抗腫瘤活性越來越受到人們的重視，特別是其對(duì)肝癌的治療作用.但由于其半衰期非常短，使得應(yīng)用受到一定限制.脂質(zhì)體作為一種新興劑型，具有延緩藥物釋放的作用，并且對(duì)肝臟具有一定的靶向作用，因此將木犀草素包入脂質(zhì)體中將會(huì)延長其半衰期并增加靶向性[2]，此外粒徑在200 nm左右的脂質(zhì)體在肝脾中停留時(shí)間明顯延長[3]，從而增強(qiáng)了治療作用.本文嘗試采用乙醇注入法制備木犀草素脂質(zhì)體.

1 儀器和試劑

LC-2010AHT型高效液相色譜儀(日本島津公司)，HJ-6A型數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，DELTA320PH計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，Sartorius BT25S電子天平(德國Sartorius公司)，KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Zetasizer激光粒度儀(英國malvern公司).

大豆卵磷脂(上海太偉有限公司)，膽固醇(上海東尚實(shí)業(yè)有限公司)，木犀草素(95%，南京替斯艾莫研究所)，木犀草素對(duì)照品(中國生物制品研究所)，乙醇(天津市恒興化學(xué)試劑有限公司)SephadexG-50(瑞典Pharmacia公司)，曲拉通X-100(Sigma公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用高效液相色譜法.精密量取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，溶解于10 mL容量瓶中，配制100 μg/mL的溶液待用.精密量取溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.3、1.6、3.2 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容到刻度，配成4.0、10、16、20、26、32、64 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液.每次進(jìn)樣10 μL，以對(duì)照品峰面積為Y軸，對(duì)照品質(zhì)量濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.從圖1可見，木犀草素在1.0～32 μg/mL范圍內(nèi)線性良好.

圖1 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 脂質(zhì)體的制備

滴管吸取適量溶于乙醇的磷脂、膽固醇，以緩慢速度滴于適量PBS中，滴定過程將尖端插入液面以下，同時(shí)攪拌子高速旋轉(zhuǎn).滴定結(jié)束后直到所形成的溶液無有機(jī)溶劑味道停止加熱和攪拌，得到的混懸液即為脂質(zhì)體溶液[4-5].

2.3 包封率的測定

2.3.1微柱離心分離脂質(zhì)體的方法考察

SephadexG-50凝膠粉末放入蒸餾水中煮沸2 h，使其充分溶脹，加入PBS(pH=7.4)，抽出其中氣泡備用.取2 mL注射器外殼，底部鋪薄層脫脂棉，裝入凝膠，使其靜止高度達(dá)到2.3 mL[6].

取0.15 mL脂質(zhì)體樣品上樣微型柱，將微型柱放入5 mL離心管中，以4 000 r/min，離心3 min，取離心后液體，加10%曲拉通X-100乙醇液適量破乳，定容10 mL.離心后的微型柱每次加3 mLPBS，重復(fù)取樣15次，經(jīng)HPLC檢測，離心6次后，脂質(zhì)體樣品中的木犀草素檢測不到，因此確定微柱離心的次數(shù)為6次.

2.3.2包封率的測定

取脂質(zhì)體樣品0.15 mL上樣，每次離心后加3 mLPBS，收集前6次離心液放入刻度試管，加2 mL10%曲拉通X-100乙醇溶液充分震蕩進(jìn)行破乳，甲醇定容10 mL，HPLC測定，記錄峰面積①.另取脂質(zhì)體1.5 mL，甲醇定容至10 mL，HPLC測定，記錄峰面積②，包封率=①/②*100%.

2.4 優(yōu)選最佳工藝

2.4.1單因素考察

1)滴速 固定其他因素，以30、60、90、120 滴/min的滴速滴于緩沖液中，制備脂質(zhì)體.得到的包封率分別為68.2%、70.1%、71.7%、69.4% .滴速對(duì)脂質(zhì)體包封率幾乎無影響，慢滴速雖然在滴入后的狀態(tài)很好，但由于處在高溫狀態(tài)，很難保證磷脂的被氧化.而高滴速滴入的狀態(tài)不是很好，因此選擇60 滴/min為宜.

2)溫度 固定其他因素，以45、50、55、60、65 ℃的溫度制備脂質(zhì)體，得到的包封率分別為67.6%、65.3%、69.4%、68.8%、70.3%.結(jié)果相差不多，說明溫度對(duì)脂質(zhì)體包封率影響不大.高于磷脂相轉(zhuǎn)變的溫度對(duì)脂質(zhì)體包封率幾乎無影響，但低溫度乙醇揮發(fā)太慢，不利于注入法制備脂質(zhì)體，而高溫度會(huì)加速脂質(zhì)體的氧化，因此選擇一個(gè)合適的溫度范圍，對(duì)制備脂質(zhì)體尤為重要.

3)磷脂用量 固定其他因素，分別以300、400、500、600、700、800 mg的磷脂質(zhì)量制備脂質(zhì)體，得到的包封率分別為50.3%，65.5%，66.7%，69.3%，72.3%，72.5%.磷脂量對(duì)包封率有影響，隨著磷脂用量的增加包封率加大.300～600 mg質(zhì)量的磷脂都能制備出狀態(tài)良好的脂質(zhì)體，但600～800 mg的磷脂包封率已無太大區(qū)別，因此考慮經(jīng)濟(jì)因素正交實(shí)驗(yàn)選擇400、500、600 mg.

4)磷脂膽固醇質(zhì)量比 固定其他因素，以6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、12∶1的類酯比制備脂質(zhì)體，得到脂質(zhì)體包封率分別為72.6%、73.4%、68.9%、65.3%、64.2%、62.1%.說明類酯比對(duì)包封率有影響，磷脂膽固醇比在7∶1時(shí)，包封率最高.

5)藥脂比 固定其他因素，選擇藥脂比1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10制備脂質(zhì)體，得到脂質(zhì)體包封率分別為72.3%、71.8%、62.4%、62.1%、60.1%、60.5%.說明藥脂比對(duì)包封率有影響，當(dāng)藥脂比在1∶5時(shí)包封率最高，隨著藥脂比增加，包封率降低.

6)有機(jī)相和水相比 以乙醇和緩沖液的體積比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3制備脂質(zhì)體，固定其他因素，得到的包封率分別為66.3%，68.7%，63.3%，52.3%，54.1%.說明有機(jī)相，水相比影響包封率，當(dāng)有機(jī)相和水相比為2∶1時(shí)包封率最高.

2.4.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述單因素考察結(jié)果，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn).因素水平表及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見表1、2.

表1 因素-水平表

因素水平1231．(磷脂用量)4005006002．(類脂比)6∶18∶110∶13．(藥脂比)1∶51∶71∶94．(油水比)2∶11∶11∶2

表2 木犀草素脂質(zhì)體正交設(shè)計(jì)結(jié)果(n=3)

A(磷脂)B(PC：ChO)C(藥脂比)D(油水比)包封率/%1111166．32122271．83133369．84212361．05223170．76231268．77313279．38321362．79332177．6Ij69．368．965．971．5IIj66．868．470．173．3IIIj73．272．073．364．5R6．43．67．48．8

采用直觀分析法分析,結(jié)果表明,各因素對(duì)包封率的影響程度為: D>C>A>B.最佳組合為A3B1C3D2，即磷脂用量600 mg、磷脂與膽固醇的比例為6∶1、藥脂比1∶9、油水比1∶1.

2.5 最佳工藝驗(yàn)證

精密稱量磷脂600 mg，膽固醇100 mg，木犀草素67 mg，乙醇和PBS各20 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，五次測量結(jié)果見表3.

表3 五次測量結(jié)果

12345平均值包封率/%79．378．576．880．677．878．6±1．45

2.6 粒度測定

將脂質(zhì)體樣品稀釋若干倍，以Zetasizer 激光粒度儀測量粒徑，見圖2，粒徑平均分布在206 nm左右.

圖2 木犀草素脂質(zhì)體粒徑分布示意圖

3 討 論

本研究確定了乙醇注入法制備木犀草素脂質(zhì)體的方法.首先通過對(duì)滴速、溫度、磷脂用量、磷脂膽固醇質(zhì)量比、藥脂比和有機(jī)相與水相比進(jìn)行單因素考察，得到的結(jié)果60 滴/min的滴速為宜、溫度對(duì)脂質(zhì)體包封率影響不大、隨著磷脂用量的增加脂質(zhì)體的包封率增大、磷脂膽固醇質(zhì)量比7∶1和藥脂比在1∶5時(shí)包封率最高，同時(shí)有機(jī)相與水相比也會(huì)影響包封率，當(dāng)有機(jī)相和水相比為2∶1時(shí)包封率最高.然后根據(jù)單因素考察結(jié)果，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳組合為磷脂用量600 mg、磷脂與膽固醇的比例為6∶1、藥脂比1∶9、油水比1∶1.最后本實(shí)驗(yàn)對(duì)此最佳制備工藝的驗(yàn)證表明包封率均在80%左右穩(wěn)定保持穩(wěn)定，并且粒徑保持在200 nm.

[1] 張芳芳, 沈漢明, 朱新強(qiáng). 木犀草素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 35(5): 573.

[2] 黃 杰, 仵文英. 脂質(zhì)體制劑抗腫瘤應(yīng)用及進(jìn)展[J]. 西部藥學(xué), 2007, 4(3): 158

[3] NAGAYASU A, UCHIYAMA K, KIWADA H. The size of liposomes: a factor which affects their targeting efficiency to tumors and therapeuticactivity of liposomal antitum or drugs [J]. Advanced Drug Deliver Reviews, 1999, 40 (1-2): 75-77.

[4] 鄧英杰. 脂質(zhì)體[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2007.

[5] ZUIDAM N J, DE VREH R, CROMMELIN D J A. Characterization of liposomes [M]. New York: OxfordUniv Press, 2003.

[6] 秦 晶, 陳大為, 喬明曦, 等. 微柱離心法測定阿魏酸脂質(zhì)體包封率[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2007，42(14): 1116-1117.

Preparation of luteolin liposome by ethanol injection

LIU Fei, LI Ming, SHENG Ming-ming, YAN Xue-ying

(School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040)

To investigate the preparation of ethanol injection of luteolin liposome, the liposome was prepared by ethanol injection. Entrapment rate was measured by microcolumn offcenter and HPLC. The particle size of luteolin liposome was measured by using the laser particle size analyzer. Orthognal test L9(34)was applied to choose the best method, and the result was as follows: PC (600 mg), PC∶Cho (6∶1), cho∶PC (1∶9), ethanol∶PBS (1∶1), entrapment rate of 79.3%. The shape and stability were good. The method of ethanol injection of luteolin liposome was easy, and the dosage was stable. So this method could be applied in luteolin liposome preparation.

luteolin; liposome; ethanol injection; orthogonal test

2014-04-29.

劉 菲(1988-)，女，碩士，研究方向：緩控釋制劑.

閻雪瑩(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：緩控釋制劑.

TQ461

A

1672-0946(2015)05-0540-03