牛志剛 王新新 吳亮,3 楊靜

（1中海油能源發(fā)展采油服務(wù)公司 天津 300452 2中海石油環(huán)保服務(wù)有限公司 天津 300452 3中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266100)

含油污泥是石油生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的一種重要的工業(yè)污染物，主要是由高濃度的石油烴和泥砂等成分組成的一種極為復(fù)雜的危險固體廢棄物。特別是其中含有的高濃度多環(huán)芳烴等有機烴類污染物具有強烈的致癌致畸致突變的“三致”效應(yīng)，對生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定和人體健康構(gòu)成了巨大威脅[1]。目前多環(huán)芳烴已被世界上多個國家和地區(qū)列為優(yōu)先控制污染物，因此急需快速有效的處理技術(shù)根治這類污染物。目前，超聲凍融法、表面活性劑洗脫和熱化學(xué)法等物理化學(xué)技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用于含油污泥的處理[2,3]。盡管物理化學(xué)處理技術(shù)具有速度快、效果好的優(yōu)點，但是處理費用過于昂貴并且容易造成生態(tài)環(huán)境的二次污染。生物處理方法利用生物的代謝活動將污染物逐漸降解，具有費用低廉和環(huán)境友好等突出優(yōu)點，因而受到各國科研人員的重視[4,5]。采用多環(huán)芳烴降解菌降解含油污泥中的多環(huán)芳烴是治理這一優(yōu)先控制污染物的有效方法[6]，因此有必要對其中含有的多環(huán)芳烴降解菌進行深入分析。然而，目前關(guān)于含油污泥中多環(huán)芳烴降解菌的分離并不多見。目前僅有Bacillus和Pseudomonas等多環(huán)芳烴降解菌生存在含油污泥中的報道[7]。因此，急需獲得更多的含油污泥多環(huán)芳烴降解菌菌株，以豐富降解菌資源。

本研究采用富集培養(yǎng)方法從典型含油污泥樣品中分離多環(huán)芳烴降解菌，綜合采用16SrRNA基因序列和生理生化方法對其進行鑒定，進一步分析其生長特性和降解特性，以期獲得含油污泥中多環(huán)芳烴降解菌多樣性的基本信息，為含油污泥的生物處理提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集某油田的典型含油污泥。采用常規(guī)分析方法分析該含油污泥樣品的全氮、有機質(zhì)、含水量、pH值和石油烴等基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試含油污泥的基本理化性質(zhì)

1.2 多環(huán)芳烴降解菌的富集和分離

取10g含油污泥放入90mL以多環(huán)芳烴萘、蒽、菲和芘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中。于30℃搖床120r·min-1恒溫富集培養(yǎng)10d。吸取10mL富集培養(yǎng)液，接種到90mL新鮮的無機鹽培養(yǎng)基中。不斷重復(fù)上述操作，富集培養(yǎng)3次。從含有以多環(huán)芳烴萘、蒽、菲和芘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基平板上采用稀釋平板涂布法分離純化單菌落[8]。

1.3 多環(huán)芳烴降解菌的鑒定

將分離獲得的純菌株接種到TSB培養(yǎng)基上，觀察記錄菌落形態(tài)并進行革蘭氏染色。采用Omega細菌DNA提取試劑盒和Omega瓊脂糖凝膠回收試劑盒提取純化菌株基因組DNA。采用細菌16SrRNA通用引物27F和1492R進行PCR擴增，并進一步純化[9]。采用ABI3730XLDNAanalyzer進行測序。將得到的序列用BLAST程序與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫進行比對，手動下載相似性較高的16SrRNA序列，并采用ClustalW程序進行多序列對齊。采用MEGA4.0軟件的Neighbor-Joining方法和Jukes-Cantor模型進行系統(tǒng)發(fā)育分析，重復(fù)取樣1000次進行自展值分析[10]。該菌株16SrRNA序列的登錄號為：KM525670。采用常規(guī)方法進一步進行生理生化鑒定分析。

1.4 多環(huán)芳烴降解菌的生長特性和降解特性

分別以10%的接種量將菌液接種到以石油烴、正十六烷、多環(huán)芳烴萘、菲、蒽和芘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，30℃搖床120r·min-1恒溫培養(yǎng)15d。以不添加碳源的接菌培養(yǎng)基作為空白對照，測定各培養(yǎng)液的OD600，以考察菌株對烴類底物的利用能力。采用氣相色譜法測定殘留多環(huán)芳烴的含量，考察菌株對多環(huán)芳烴的降解能力[9]。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對測試數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多環(huán)芳烴降解菌的分離

通過富集馴化和分離純化等步驟，經(jīng)過初篩復(fù)篩，得到一株多環(huán)芳烴降解菌W13020。該菌株在TSB培養(yǎng)基上的菌落呈淺黃色，表面濕潤，略透明，邊緣整齊、菌落圓形，扁平。顯微觀察革蘭氏染色陰性，細胞呈桿狀。采用16SrRNA序列分析對其進行鑒定，進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。菌株W13020與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia MTCC 434T的同源性高達99.0%，高于其他模式菌株。采用常規(guī)方法進一步進行生理生化鑒定分析，結(jié)果如表2所示。該菌株可耐受4%NaCl，生長pH值5~9，可以利用土溫80、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖和果糖。產(chǎn)生蛋白酶和DNA酶，而不產(chǎn)生氧化酶和脲酶。具有明膠液化和硝酸鹽還原能力，H2S和甲基紅實驗陰性。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果和生理生化分析結(jié)果，該菌株可被鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia。

圖1 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 的生理生化特征

1960年Hugh R等[11]發(fā)現(xiàn)并命名了嗜麥芽假單胞菌（Pseudomonasmaltophili）。1983年Swings J等[12]通過表型數(shù)據(jù)分析又將其命名為嗜麥芽黃單胞菌（Xanthomonasmaltophili）。1993年P(guān)alleroni NJ等[13]再一次將其命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）。Carmody LA等[14]通過對766株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌進行詳細的生理生化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種菌的生理生化特征具有明顯的多樣性，這也印證了對該菌的鑒定具有一定困難。我們通過16S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，菌株W13020與StenotrophomonasmaltophiliaMTCC 434T的同源性高達99.0%，并且生理生化分析結(jié)果與模式菌株基本一致。因此，將菌株W13020鑒定為嗜麥芽黃單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia是可靠的。

采用氣相色譜法分析多環(huán)芳烴降解菌W13020對4種多環(huán)芳烴的降解率，結(jié)果如圖2所示。W13020菌株對萘、蒽、菲和芘的15d降解率分別為72.1±3.7%、45.1±15.6%、42.2±5.2%和31.2±9.0%，說明W13020菌株對多環(huán)芳烴具有明顯的降解能力。其中，該菌對萘的降解率顯著（P<0.05）高于其它3種多環(huán)芳烴，說明該菌對低分子量多環(huán)芳烴的降解能力較強。此外，該菌株不能利用正十六烷，但是可以利用石油烴為唯一碳源和能源生長。這可能是由于該菌利用石油烴里的多環(huán)芳烴組分造成的。Stenotrophomonas maltophilia的多環(huán)芳烴降解能力多有報道。Gao S等[15]從雜酚油污染土壤中分離得到了一株Stenotropho monasmaltophilia C6，并深入研究了該菌株降解菲的降解途徑，識別了22個中間代謝產(chǎn)物。Chen S等[16]發(fā)現(xiàn)Stenotropho monasmaltophilia在銅離子存在的情況下仍然可以降解苯并芘。Urszula G等[17]從活性污泥中分離得到了一株Stenotropho monasmaltophilia KB2，可以降解苯酚和兒茶酚等單環(huán)芳烴，并具有兒茶酚1,2-雙加氧酶活性。然而，具有多環(huán)芳烴降解能力的Stenotropho monasmaltophilia并未發(fā)現(xiàn)存在于含油污泥中。本研究通過富集培養(yǎng)從含油污泥中分離得到了一株可以降解萘、蒽、菲和芘的Stenotrophomonas maltophilia W13020，證實了Stenotropho monasmaltophilia也生存于含油污泥的環(huán)境中。

圖2 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 對4 種多環(huán)芳烴的降解率

3 結(jié)語

本研究從含油污泥中分離得到一株多環(huán)芳烴降解菌W13020。采用16S rRNA基因序列和生理生化方法將其鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia。該菌株可以利用石油烴、多環(huán)芳烴萘、菲、蒽和芘為唯一碳源和能源生長，對萘、蒽、菲和芘等多環(huán)芳烴具有明顯的降解能力。

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