張 娜 黃 雯 許 飛 李 莉 張國范 郭希明

(1. 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術國家地方聯(lián)合工程實驗室 中國科學院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國科學院大學 北京 100049;3. Haskin Shellfish Research Laboratory, Institute of Marine and Coastal Sciences, Rutgers University, Port Norris, New Jersey USA 08349)

Dmrt (Doublesex and mab-3 related transcription factor)是近年來比較受關注的一個基因家族, 因為這個家族中的一些基因在無脊椎和脊椎動物中都與性別決定和兩性分化相關。DM 結構域最先在果蠅(Drosophila melanogaster)的性別調控基因Doublesex中發(fā)現(xiàn)的(Burtis et al, 1989), 隨后又在很多物種, 如魚類(Guan et al, 2000; Marchand et al, 2000; Kondo et al, 2002; Nanda et al, 2002; Koopman et al, 2003;Ohmuro-Matsuyama et al, 2003)、鳥類(Raymond et al,1999; Smith et al, 1999; Ren et al, 2001)、爬行類(Raymond et al, 1999; Smith et al, 1999; Kettlewell et al, 2000)和哺乳類(Raymond et al, 1998; Raymond et al, 1999; Smith et al, 1999; De Grandi et al, 2000;Moniot et al, 2000; Kim et al, 2003)的同源基因中都發(fā)現(xiàn)了它的存在, 說明該家族的基因在無脊椎和脊椎動物中都是高度保守的。長牡蠣(Crassostrea gigas)中共編碼 3個含有 DM 結構域的基因, 分別是Cg-DM1(CGI_10015952), CgDsx(CGI_10019568)以及CgDmrtA2 (CGI_10001830) (Zhang et al, 2014)。編號為CGI_10015952的基因最初被Naimi等(2009)認定為 Cg-DMl, 并認為該基因具有與性腺發(fā)育相關的作用。CGI_10019568基因含有典型的 DM 結構域, 而且與果蠅的Doublesex (Dsx)基因同源關系很近, 因此被命名為CgDsx (Zhang et al, 2014)。果蠅的Dsx基因與線蟲的Mab-3以及脊椎動物的Dmrt1基因都對雄性的性別決定起著關鍵的作用。果蠅的Dsx基因可通過可變剪切在卵巢和精巢中分別產生雌性和雄性兩種剪切形式(Burtis et al, 1989)。線蟲的Mab-3與脊椎動物的 Dmrt1基因都在雄性性腺中特異表達并促進雄性特征的發(fā)育(Smith et al, 2009; Kopp, 2012)。

CGI_10001830除了含有Dmrt家族共有的DM保守結構域外, 還含有 Dmrt家族的亞族(subfamily)DmrtA的DMA結構域, 而且其與 DmrtA2(Dmrt5)同源性很高, 因此將其命名為 CgDmrtA2 (Zhang et al,2014)。DmrtA家族成員包括Dmrta1(Dmrt4), Dmrta2(Dmrt5), Dmrta3(Dmrt3) (Volffet al, 2003)。在小鼠中,Dmrt4在各組織中都有表達(Balciunieneet al, 2006)。牙鲆(Paralichthys olivaceus)的 Dmrt4在精巢中表達量很高, 在卵巢中幾乎沒有表達, 另外在腦部和鰓中的表達量也遠遠高于其它組織, 因而牙鲆的Dmrt4在性腺, 神經以及感覺器官的發(fā)育過程中可能起到重要作用(Wen et al, 2009)。而該基因在青鳉中的表達模式卻很特殊, 只在耳板和苦膽中表達(Winkler et al,2004)。在斑馬魚胚胎發(fā)育時期, Dmrt5在原腸胚后期表達量很高, 并主要表達于胚胎時期的中樞神經系統(tǒng), 特別是中腦及中后腦的神經系統(tǒng), 而且其在斑馬魚的雌雄性腺的生殖細胞中均有表達(Guoet al,2004)。在斑馬魚體節(jié)發(fā)生過程中, Dmrt5只在端腦,中腦和嗅板中表達, 其對后部-背部端腦細胞的分化起著重要的作用(Yoshizawa et al, 2011)。Dmrt5在非洲爪蟾蜍胚胎發(fā)育過程中, 對于神經系統(tǒng)的發(fā)生具有重要的調節(jié)作用(Parlier et al, 2013)。另外, Dmrt5對小鼠胚胎早期大腦的皮層及腹側中腦神經系統(tǒng)的發(fā)育都是不可或缺的(Kim et al, 2003; Gennet et al,2011; Konno et al, 2012; Saulnier et al, 2013)。在斑馬魚中, Dmrta3即Dmrt3對于嗅板、神經管和生殖細胞的發(fā)育都具有潛在的影響(Li et al, 2008)。在小鼠和雞中, Dmrt3只在胚胎中表達, 其中在小鼠胚胎的前腦,神經管和鼻腔結構中表達, 在雞胚胎早期形成的體節(jié),體節(jié)前中胚層以及勒氏管中表達(Smith et al, 2002)。

Cg-DM1(CGI_10015952)基因已被詳細報道過(Naimiet al, 2009)。Zhang等(2014)通過對基因組和轉錄組的分析發(fā)現(xiàn)CgDmrtA2可能和性別決定無關, 而CgDsx可能和性別決定有關。鑒于Zhang等的結果是基于有限的轉錄組數(shù)據(jù), 因此作者進一步通過實時熒光定量PCR分析對Zhang等的轉錄組結果加以印證, 對長牡蠣的CgDsx以及CgDmrtA兩個基因進一步分析, 研究這兩個基因在長牡蠣的雌雄個體、組織間的表達特征以及在幼蟲各發(fā)育時期的時空表達模式, 以確定這兩者在長牡蠣性別決定中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用成體長牡蠣于2013年5月取自青島市嶗東養(yǎng)殖場, 為處于成熟期的二齡牡蠣, 用顯微鏡檢驗雌雄后分別取三只雌性和三只雄性的外套膜、鰓、閉殼肌和性腺組織樣品用于RNA提取。幼蟲樣品也取自青島嶗東海珍品良種培育有限公司, 發(fā)育時期通過顯微鏡觀察確定后, 在適當?shù)臅r間點取樣。樣品取出后立刻用液氮冷凍, 隨后轉移到–80°C冰箱保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA模板的合成

將取得的樣品用液氮充分研磨之后取 100mg左右的干粉將之加入Trizol Reagent (Invitrogen)中并按照說明書進行總 RAN的提取。提取到的總 RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA的完整性, 用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)檢測純度與濃度。cDNA的合成使用PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒, 根據(jù)使用說明, 每20μL反應體系加入1μg的總RNA進行反轉錄, 得到的cDNA用于下一步的熒光定量PCR反應。

1.3 引物設計

本實驗所涉及的引物序列詳見表 1。引物使用Primer Premier 5.0軟件進行設計, 送上海生工(Sangon)生物技術有限公司合成。引物稀釋成10μmol/mL的濃度備用。

表1 實驗涉及引物名稱、序列及產物長度Tab.1 Primer name, sequence, and product length used in this study

1.4 序列比對

CgDsx以及 CgDmrtA2的蛋白序列可從 http://oysterdb.cn/上獲得, 并在NCBI上搜索相關的同源蛋白序列, 用于蛋白序列比對分析。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

根據(jù)已知的CgDsx以及CgDmrtA2序列進行引物設計, 幼蟲時期的內參基因使用 Ribosomal protein S18 (RS18), 成體時期的內參基因使用(Eukaryotic translation elongation factor 2 (EF2))。采用相對定量的方法對長牡蠣這兩個 DM 家族基因在成體各組織及幼蟲各時期的表達進行測定。實驗采用ABI7500 Fast熒光定量PCR儀, SYBR Green I 熒光染料。反應體系如下:

反應條件: 95°C 30s, 一個循環(huán); 95°C 5s, 60°C 30s, 40個循環(huán)。每個樣品做3個重復, 另外再做3個無模板的陰性對照。通過ABI 7500 V2.0.2軟件輸出反應的Ct值, 采用2–ΔΔCt法對這兩個基因在不同組織和不同幼蟲時期的表達差異進行相對定量研究。

表2 幼蟲分期明細Tab.2 Details of larval stages

2 結果

2.1 長牡蠣CgDsx與CgDmrtA2基因的同源比較與進化分析

2.1.1 CgDsx的同源比較與進化分析 CgDsx的序列分析及同源關系比對已經在Zhang等(2014)的文章中詳細闡述過, 這里僅展示其與其它物種同源基因的蛋白序列比對結果(圖1)。從圖1中可以看出, 長牡蠣的 CgDsx氨基酸序列與其它物種的同源性不高,DM家族的成員之間除了共有的一個DM結構域之外,其它序列的保守性很低(Kopp, 2012)。

2.1.2 CgDmrtA2的同源比較與進化分析 長牡蠣的CgDmrtA2的ORF長1173bp, 編碼390個氨基酸,含有2個外顯子。該基因除了含有典型的DM結構域外, 還含有一個DmrtA家族特有的DMA結構域。而且該基因與 Dmrta2/Dmrt5親緣關系較近, 因此被命名為DmrtA2 (Zhang et al, 2014)。CgDmrtA2與小鼠的Dmrta2(Dmrt5)同源性達到79% (e-value 5e-31), 與人類的同源性為77% (e-value 2e-31), 與斑馬魚的同源性為36% (e-value 2e-46), 與東方紅鰭豚的同源性為37% (e-value 3e-44)。目前沒有軟體動物 Dmrta2/Dmrt5方面的報道, 也沒有相關的數(shù)據(jù)可供比對, 目前數(shù)據(jù)顯示, 牡蠣 CgDmrtA2與哺乳動物的 Dmrta2(Dmrt5)同源性更高。

2.2 長牡蠣CgDsx和CgDmrtA2基因的時空表達分析

2.2.1 長牡蠣CgDsx和CgDmrtA2基因在幼蟲時期的表達分析 實驗測定了包括卵子在內, 直至稚貝的27個時期(見表2)的表達模式。CgDsx在卵子到D型幼蟲中后期的表達量較高, D型幼蟲后期到稚貝期表達量開始降低, 卵子到 D型幼蟲中后期的表達量平均值是其后表達量平均值的4.15倍。CgDmrtA2在卵子和二細胞期的表達量都很低, 到桑椹期開始增高, 到D4期的時候達到最高, 隨之稍有下降, 到U11期又達到一個較高的水平, 到U30期降到低點, 之后未有明顯升高。

圖1 長牡蠣和其它物種Doublesex同源基因的氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of Doublesex homolog amino acid sequences of C. gigas and other species

圖2 長牡蠣和其它物種Dmrta2/Dmrt5基因的氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of Dmrta2/Dmrt5 homolog amino acids sequences of C. gigas and other species

2.2.2 長牡蠣CgDsx和CgDmrtA2基因在不同組織中的表達分析 實驗所用成體牡蠣均為二齡成熟期個體, 實驗結果顯示, CgDsx基因在雄性性腺中的表達量顯著(P＜0.01)高于其它組織, 雄性性腺的表達量是雌性性腺的8.9倍。在除性腺之外的體細胞組織中,CgDsx表達量低, 彼此間無太大差異。CgDmrtA2基因在各組織中均有表達, 在雄性性腺中表達量最低,在雌性性腺中最高, 雌性性腺的表達量是雄性性腺的5倍, 在另外3個組織中差異也不明顯。

3 討論

Dmrt家族基因的共有特征就是一個含有鋅指結構可與特異DNA序列結合的保守結構域-DM結構域(Dmrt8除外(Veith et al, 2006))。該家族基因在許多種類, 包括節(jié)肢動物, 線蟲類以及脊椎動物中都參與調控性別的分化與發(fā)育, 因而該基因家族可能是首例廣泛分布的性別調控基因。在線蟲C. elegans中, 含有DM結構域的Mab-3基對于雄性的發(fā)育是必需的,它與果蠅中的 Doublesex基因發(fā)揮類似的作用(Shen et al, 1988; Yi et al, 1999)。在脊椎動物中, Dmrt1基因展示出在早期的雄性性腺中特異表達的模式(Zarkower, 2001, 2002)。含有Dmrt1基因的區(qū)域被報道與人類男性的性逆轉相關(Bennett et al, 1993;Crocker et al, 1988; Flejter et al, 1998; Guioli et al,1998; Veitia et al, 1997, 1998), 而且Dmrt1基因還是小鼠出生后精巢發(fā)育所必需的(Raymond et al, 2000)。珊瑚蟲中也發(fā)現(xiàn)一種含有DM結構域的基因, 它同樣表現(xiàn)出具有與性別決定和分化相關的功能(Miller et al, 2003)。

長牡蠣基因組中共發(fā)現(xiàn) 3個含有 DM結構域的Dmrt家族基因, 分別是 Cg-DM1 (CGI_10015952),CgDsx (CGI_10019568)以及CgDmrtA2 (CGI_10001830)(Naimi et al, 2009; Zhang et al, 2014)。而在線蟲、果蠅和人類中的該家族基因的數(shù)目分別是 11個、4個和7個(Matson et al, 2012)。Cg-DM1(CGI_10015952)曾被報道過(Naimi et al, 2009)。CgDsx (CGI_10019568)與果蠅的 doublesex、線蟲的Mab-3以及脊椎動物的Dmrt1是同源基因。CgDsx雖然含有3個外顯子, 但沒有表現(xiàn)出雌雄相關的可變剪切(Zhang et al, 2014)。定量 PCR結果表明它在雄性性腺中表達量最高,這和轉錄組結果一致, 它很可能在長牡蠣的性別決定中起關鍵作用或促進雄性發(fā)育。其在雌性性腺中也稍有表達, 雄性性腺的表達量是雌性性腺的 8.9倍,這或許意味著雌性性腺中存在著休眠的精子, 隨時為性別轉變做著準備。牡蠣的性腺中同時存在著兩種生殖細胞, 這或許是性別轉變的先決條件(Cole, 1941;Guo et al, 1998; Zhang et al, 2014)。

圖3 Real-time qPCR檢測CgDsx和CgDmrtA2在幼蟲時期的表達模式Fig.3 Expression profiles of CgDsx and CgDmrtA2 in larval stages幼蟲分期詳見表2

圖4 CgDsx和CgDmrtA2在不同成體組織中的表達模式Fig.4 Expression profiles of CgDsx and CgDmrtA2 in different adult tissues

通過 DM 結構域的同源比對及進化分析發(fā)現(xiàn),CgDsx與果蠅的doublesex聚到一起。CgDsx與無脊椎動物的同源基因進化距離較近, 與脊椎動物的Dmrt1進化距離較遠(Zhang et al, 2014)。CgDsx在囊胚期到擔輪幼蟲初期表達量較高, 說明在該段時期的發(fā)育需要CgDsx的參與。

Cg01830(CGI_10001830)是 Dmrt家族的亞族DmrtA中的一員。通過同源比對及進化分析發(fā)現(xiàn),Cg01830與Dmrta2/Dmrt5同源關系較近(Zhang et al,2014)。據(jù)報道, Dmrt5對大腦以及神經系統(tǒng)的發(fā)育具有重要的作用(Kim et al, 2003; Guo et al, 2004;Gennetet al, 2011; Yoshizawa et al, 2011; Konno et al,2012; Parlier et al, 2013; Saulnier et al, 2013)。在長牡蠣中, 該基因在卵子和二細胞期的表達量很低, 到桑椹期開始增高, 到 U22期一直保持較高的表達量,U30期降到低點, 之后未有明顯升高。這說明,CgDmrtA2主要在長牡蠣的D形到U22期幼蟲階段合成, 在這期間發(fā)揮的作用可能也與其在斑馬魚及小鼠的胚胎中行使的功能類似, 與神經系統(tǒng)的形成相關。在成體中, 該基因在所有組織中均有表達, 雌性性腺中表達量最高, 其次是鰓和外套膜, 在雄性性腺中表達量最低, 但各組織間表達差異都不顯著。因此該基因應不參與長牡蠣的性別決定和分化等功能,其具體功能還需要進一步探索與研究。

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