王忠良 丁 燏 許尤厚 簡紀常 魯義善王 蓓 陳 剛 吳灶和,

(1. 廣東海洋大學水產(chǎn)學院 湛江 524088; 2. 廣東海洋大學南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖重點實驗室 湛江 524088; 3. 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室(欽州學院) 欽州 535000; 4. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室湛江 524088; 5. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 廣州 510225)

馬氏珠母貝(Pinctada martensii)又稱合浦珠母貝(Pinctada fucata), 是人工培育海水珍珠的主要母貝。自 1965年我國成功開展馬氏珠母貝人工育苗以來,海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速, 尤其是進入20世紀90年代后, 海水珍珠養(yǎng)殖已成為廣東、廣西和海南沿海地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)(史兼華等, 2006; Wang et al, 2009)。然而, 由于長期的人工養(yǎng)殖和近親繁殖, 馬氏珠母貝種質(zhì)已呈現(xiàn)明顯的退化現(xiàn)象, 如種苗活力下降、死亡率增加、育珠貝變小、珍珠質(zhì)量差等(Miyazaki et al, 1999;Tomaru et al, 2001; He et al, 2008)。為改善這一狀況,馬氏珠母貝的遺傳改良和優(yōu)良品種培育是當前海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的首要任務(wù), 而篩選穩(wěn)定可靠的分子標記評價其遺傳多樣性對馬氏珠母貝良種選育和種質(zhì)資源保護都具重要的指導意義。

簡單重復序列(Simple Sequence Repeats, SSR),又稱微衛(wèi)星DNA, 是指由1-6個核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復DNA序列(Powell et al, 1996; Liu et al, 2013)。與諸多分子標記相比, 具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、多等位性、共顯性和可重復性高等優(yōu)點, 已廣泛應(yīng)用于動植物遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、基因定位、遺傳多樣性、分類與進化及分子標記輔助育種等研究領(lǐng)域(趙瑩瑩等, 2006; 徐美佳等, 2009; 李云峰等, 2010;孫國華等, 2010; 劉博等, 2012; 王東等, 2014)。根據(jù)來源, SSR標記又可分為基因組 SSR(Genomic SSR,gSSR)和表達序列標簽 SSR(Expressed sequence tag SSR, EST-SSR)兩種。與gSSR標記相比, EST-SSR標記無需構(gòu)建基因組文庫, 節(jié)省了大量人力物力, 開發(fā)成本較低, 且來源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū), 其多態(tài)性與基因功能可能直接相關(guān), 同時在相近物種間具良好的通用性(Varshney et al, 2005; 李琪, 2006; 張瓊等,2010)。

近年來, 隨著EST和cDNA大規(guī)模測序技術(shù)的快速發(fā)展, 多種海產(chǎn)經(jīng)濟貝類 SSR標記的開發(fā)利用研究已相繼展開(李紅蕾等, 2003; Sato et al, 2005; 李琪,2006; 李云峰等, 2010), 但現(xiàn)有的SSR標記還非常有限, 仍不能滿足進一步研究的需要。為此, 本文基于前期Illumina高通量測序技術(shù)獲得的馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表), 利用計算機軟件輔助進行大規(guī)模EST-SSR標記的發(fā)掘, 并對其組成、分布及特征等信息進行了分析, 同時對 SSR標記的多態(tài)性進行了評價, 以期為馬氏珠母貝遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建及分子輔助育種研究提供有效工具, 促進馬氏珠母貝種質(zhì)資源保護、優(yōu)良品種培育和珍珠養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 馬氏珠母貝的暫養(yǎng)及血細胞采集

馬氏珠母貝(平均殼長 70mm)購自廣東省湛江市徐聞邁陳珍珠貝養(yǎng)殖場, 暫養(yǎng)于室內(nèi)玻璃鋼水槽中(200L水體), 每槽飼養(yǎng)20只; 水溫25°C, 鹽度28, 飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣; 暫養(yǎng)過程中以螺旋藻粉為餌料投喂,每天換水(100%)一次; 室內(nèi)暫養(yǎng)一周后采集血淋巴。

利用 1mL無菌注射器于馬氏珠母貝閉殼肌處采集血淋巴, 每只 0.5mL; 采集的血淋巴分裝至 1.5mL離心管中, 每管1mL; 4°C, 800g 離心10min 收集血細胞, 并立即進行DNA提取。

1.2 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于課題組前期利用Illumin/Hiseq-2000高通量測序平臺對馬氏珠母貝血細胞進行的全轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序共獲得70407878條原始讀數(shù)(Raw reads), 經(jīng)去除含有接頭、重復及測序質(zhì)量較低的原始讀數(shù)后, 獲得 56345139條純凈讀數(shù)(Clean reads)。使用轉(zhuǎn)錄組de novo組裝軟件Trinity(Grabherr et al, 2011)對Clean reads進行組裝,并進行去冗余處理和進一步拼接, 共得到74007條非冗余獨立基因(Unigene)。(以上轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)尚未發(fā)表,轉(zhuǎn)錄組Raw reads已提交至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫, 登錄號為SRP041567。)

1.3 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點篩選

為檢測馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組中 EST-SSR位點, 使用軟件MIcroSAtellite (MISA) (Lu et al, 2013)對組裝得到的Unigenes序列進行SSR 搜索和定位。所檢測SSR 位點共6類, 分別為單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復, 其篩選標準為: 單核苷酸重復≥10次; 二核苷酸重復≥6次; 三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復≥5次。

1.4 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR引物設(shè)計

使用Primer3軟件進行SSR引物設(shè)計, 每條SSR產(chǎn)生3對引物; 引物設(shè)計的主要參數(shù)設(shè)置如下: 引物長 18—23bp, 最適長度 23 bp; PCR擴增產(chǎn)物長度100—300bp; GC含量40%—65%, 最適含量50%; 退火溫度55—65°C, 最佳退火溫度55°C。

1.5 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR多態(tài)性檢測

1.5.1 模板DNA的制備 采用Universal Genomic DNA Mini-Isolation Kit試劑盒(上海生工生物工程有限公司), 并按照說明書方法進行血細胞 DNA的提取。經(jīng)紫外分光光度計定量后, –20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR擴增及產(chǎn)物檢測 為了篩選和驗證所設(shè)計的SSR引物, 隨機挑選80對引物(引物由上海生工生物工程有限公司合成), 以上述血細胞DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為20 μL, 包括2×ES Taq MIX 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL, 模板DNA 1 μL, ddH2O補足至 20 μL。PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性5 min, 30個循環(huán)(94°C變性30s, 最佳Tm退火 30s, 72°C延伸 30s), 最后 72°C 延伸 5 min。PCR擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染法顯色進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的分布及頻率

利用MISA軟件對馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組中的74007條Unigenes序列進行搜索, 共檢測到9872個SSR位點, 分布于8135條Unigenes序列中。SSR 發(fā)生頻率(含SSR的Unigene數(shù)/Unigene總數(shù))為10.99%, SSR出現(xiàn)頻率(檢出SSR位點數(shù)/Unigene總數(shù))為13.34%;平均每5102bp含有1個SSR位點(檢測序列總堿基數(shù)50368155 bp)。其中, 1350條Unigene含有1個以上SSR位點, 復合型SSR數(shù)目為518個。

馬氏珠母貝 EST-SSR重復類型豐富, 除六核苷酸重復外, 1—5核苷酸重復均有發(fā)現(xiàn)。其中, 單核苷酸重復有4種類型, 二核苷酸重復有11種類型, 三核苷酸重復有 52 種類型, 四核苷酸重復有 58種類型,五核苷酸重復有7種類型(表1)。從各類型SSR位點數(shù)量看, 出現(xiàn)最多的為 1—3核苷酸重復, 占總 SSR位點數(shù)的98.32%。其中, 單核苷酸重復比例最高, 占81.46%; 其次為二核苷酸重復和三核苷酸重復, 分別占10.48%和6.38%; 4—5核苷酸重復SSR數(shù)量較少,共占 1.68%(表 1)。

表1 馬氏珠母貝EST-SSRs不同重復基元分布情況Tab.1 Distribution of different repeat motifs of EST-SSRs in P.martensii transcriptome

馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組中 EST-SSR的長度在 12—20bp的有3677條, 其中單核苷酸重復SSR共計2226條; 長度超過20bp的SSR有336條, 并以單核苷酸重復SSR最多, 達129條(表2)。SSR位點重復次數(shù)方面, 以重復 10次(3883)最多, 占總 SSR位點的39.33%; 其次為重復11次和12次, 分別占17.12%和8.88%; 重復5—9次、13—17次及18—24次的SSR位點個數(shù)分別為1671、1279和472(圖1)。

2.2 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的特征

在馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組9872個SSR位點中, 共檢測到 132種重復基元(表 1)。其中, 以單核苷酸重復基元 A/T和 C/G最多, 分別占總 SSR的 71.27%和10.19%, 發(fā)生頻率分別為 9.507%和 1.359%; 其次為二核苷酸重復基元AT/AT和AG/CT, 分別占4.66%和4.24%; 三核苷酸重復單元中, 以 ATC/ATG、AAG/CTT和AAC/GTT出現(xiàn)次數(shù)最多, 分別占總SSR的2.07%、1.29%和1.16%; 四核苷酸和五核苷酸重復基元種類較多, 但數(shù)量較少, 頻率較低, 共占SSR總數(shù)的 1.67%(表 3)。

表2 馬氏珠母貝EST- SSRs長度分布情況Tab.2 Lengthdistribution of EST-SSRs in P. martensii transcriptome

圖1 馬氏珠母貝EST-SSRs重復次數(shù)分布圖Fig.1 Distribution of EST-SSR repeats frequency in P.martensii transcriptome

2.3 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR引物設(shè)計及多態(tài)性檢測

為更好地利用馬氏珠母貝 SSR位點, 本文應(yīng)用Primer3軟件對上下游序列均不小于 150 bp的EST-SSR設(shè)計引物, 每條序列產(chǎn)生 3對引物。經(jīng)SSRFinder校驗及除去不符合條件的引物后, 共為5922條EST-SSR序列成功設(shè)計出17766對引物, 占馬氏珠母貝SSR總數(shù)的59.99%。

從上述設(shè)計引物中隨機挑選 80對引物, 并以隨機挑選的20只健康馬氏珠母貝血細胞基因組DNA為模板進行PCR擴增以驗證設(shè)計的EST-SSR引物。結(jié)果表明, 共有 62對引物成功擴增出穩(wěn)定條帶, 占引物總數(shù)的 77.5%, 但其中有 23對引物擴增產(chǎn)物片段與預(yù)期產(chǎn)物片段大小不符; 在62個SSR位點中, 以二堿基、三堿基重復類型的 SSR位點擴增成功率較高; 此外, 17對 EST-SSR引物(占擴增引物總數(shù)的21.25%)表現(xiàn)出個體多態(tài)性(表 4), 多態(tài)性比率為27.42%; 17對多態(tài)性引物所在SSR位點中, 有7個為二堿基重復, 6個為三堿基重復, 2個為單堿基重復,四堿基重復和五堿基重復各1個。

3 討論

目前, 有關(guān)貝類微衛(wèi)星標記的研究主要是通過構(gòu)建cDNA文庫來獲得含有微衛(wèi)星的序列, 并且設(shè)計引物對微衛(wèi)星標記進行篩選(Sato et al, 2005; 李春艷等, 2009)。如石耀華等(2008)從馬氏珠母貝9個組織的SMART cDNA文庫中共獲得6979條EST序列, 并篩選到268個SSR位點, SSR出現(xiàn)頻率為3.48%; 同樣, 李云峰等(2010)從蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis) cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了74個SSR重復序列(2007條EST序列), SSR出現(xiàn)頻率為3.69%。與上述傳統(tǒng) EST-SSR標記開發(fā)技術(shù)相比, 基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序的 SSR標記開發(fā)技術(shù)不僅可以借助更全面的數(shù)據(jù)信息, 提高遺傳多樣性研究的準確性, 而且開發(fā)的SSR標記同樣具有EST-SSR標記的諸多優(yōu)點。王學穎(2012)從馬氏珠母貝珍珠囊轉(zhuǎn)錄組的99127條無冗余EST序列中共發(fā)現(xiàn)了6595個SSR位點, SSR出現(xiàn)頻率為6.65%; 同樣, 本文利用 MISA軟件從馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組74007條Unigenes中共檢索出9872個SSR位點, 分布于8135條Unigenes中, SSR出現(xiàn)頻率高達 13.34%。因此, 結(jié)合其它動植物 SSR開發(fā)相關(guān)文獻和本研究結(jié)果表明, 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選 SSR標記是發(fā)掘非模式生物 EST-SSR的一種快速、高效的方法, 應(yīng)用前景廣闊。

表3 馬氏珠母貝EST-SSRs重復基元的類型及頻率Tab.3 EST-SSR repeats motifs and the frequency in P. martensii transcriptome

根據(jù)現(xiàn)有報道, 蝦夷扇貝和馬氏珠母貝的EST-SSR均以二核苷酸重復基元為主, 其所占比例分別為 40.54%和 48.5% (石耀華等, 2008; 李云峰等,2010); 縊蟶(Sinonovacula constricta)SSR以三核苷酸重復SSR比列最高, 為37.13%(劉博等, 2012); 此外,基于馬氏珠母貝珍珠囊轉(zhuǎn)錄組的 SSR分析中, 四堿基重復基元占總EST-SSR的40%(石耀華等, 2008)。而本研究中以單核苷酸重復基元為主, 比列達到81.46%。造成以上差異的原因, 除EST序列獲取方法不同外(王學穎, 2012), 在一定程度上與搜索 SSR時設(shè)置的參數(shù)有很大的關(guān)系(Wei et al, 2011)。Aggarwal等(2007)發(fā)現(xiàn), 如果改變 SSR搜索標準(提高二核苷酸重復基元的重復次數(shù), 或降低三核苷酸重復基元的重復次數(shù)), 原本二核苷酸重復 SSR占優(yōu)勢的研究中, 便會出現(xiàn)三核苷酸重復SSR占優(yōu)勢的情況; 同樣,若本研究中提高單核苷酸 SSR的重復次數(shù), 則 SSR將以二核苷酸重復基元為主。因此, 亟需建立一個統(tǒng)一的 SSR檢測參數(shù)標準以便有效比較不同研究中同一或相近物種SSR分布的類型與特點。

表4 17對多態(tài)性EST-SSRs引物序列及擴增參數(shù)Tab.4 Sequences and amplification parameters of the 17 EST-SSRs primers

研究表明, SSR標記可用性的重要依據(jù)——多態(tài)性的高低, 主要取決于的其長度大小(李珊等, 2010)。當SSR長度≥20bp時其多態(tài)性較高, 長度在12—20bp之間的SSR則呈現(xiàn)中等多態(tài)性, 而長度＜12bp時多態(tài)性較低(楊華等, 2011)。本研究中, 長度在 12—20bp之間的SSR有3677條(占SSR總數(shù)的37.25%), 這些SSR具中等多態(tài)性; 而長度≥20bp的SSR有336條(占SSR總數(shù)的 3.4%), 此類SSR呈較高的多態(tài)性。此外, 本研究中20bp以上的低級重復基元(一、二、三核苷酸重復基元)較多, 共計 279條(占 20bp以上SSR的83.04%)。由此可預(yù)見馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組來源的 SSR具有較高的多態(tài)性潛能, 在分子標記研究方面將具有較高的利用價值(Dreisigacker et al, 2004)。

為檢測轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR的多態(tài)性, 隨機挑選了80對引物進行PCR擴增, 其中62對引物成功擴增出穩(wěn)定條帶, 但仍有18條引物未能擴增出產(chǎn)物。這可能是由于所設(shè)計的引物序列位于兩個外顯子上, 或者基因組對應(yīng)序列含有內(nèi)含子而不具備SSR序列特征等原因造成(Varshney et al, 2005)。此外,本研究出現(xiàn)了 23對引物擴增產(chǎn)物片段與預(yù)期產(chǎn)物片段大小不符的現(xiàn)象, 而該現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在櫛孔扇貝和縊蟶的 EST-SSR擴增產(chǎn)物中(李紅蕾等, 2003;劉博等, 2012)。究其原因, 有學者認為其與引物的非特異性結(jié)合(錯配)或基因組 DNA序列含有內(nèi)含子等相關(guān)(李紅蕾等, 2003; Saha et al, 2004)。17對多態(tài)性引物所在SSR位點中, 多為二、三核苷酸重復, 這從某種程度上也驗證了低級重復基元多態(tài)性高于高級重復基元多態(tài)性的推斷(Dreisigacker et al,2004)。

4 結(jié)論

本研究利用馬氏珠母貝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 篩選獲得了9872個EST-SSR位點, 位點出現(xiàn)頻率達13.34%;同時, 共為5922條EST-SSR序列成功設(shè)計出17766對引物; 隨機選擇的 80對擴增引物中, 共有 17對EST-SSR引物表現(xiàn)出個體多態(tài)性, 多態(tài)性比率為27.42%。以上研究結(jié)果對于豐富馬氏珠母貝分子標記類型、加速功能基因資源的利用、探究種群遺傳結(jié)構(gòu)、分析遺傳多樣性、保護種質(zhì)資源和培育優(yōu)良品種均具有重要意義。

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