鄭唐春 臧麗娜 代麗娟 劉彩霞 曲冠證

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

責(zé)任編輯:潘 華。

植物的開花是一個(gè)高度復(fù)雜而復(fù)合的、在一定遺傳背景控制下的生理生化及形態(tài)發(fā)生過程。表現(xiàn)為植物接受環(huán)境條件誘導(dǎo)、信號(hào)傳導(dǎo)、開花決定基因控制及諸多代謝途徑的相互制約下，引起花芽分化，進(jìn)而導(dǎo)致器官發(fā)生。根據(jù)前期的大量研究，擬南芥中已知有多種遺傳途徑參與成花轉(zhuǎn)變，例如光周期途徑、春化途徑、自主途徑及赤霉素途徑等［1-4］。Flowering Locus C(FLC)和Short Vegetative Phase(SVP)是開花信號(hào)整合子的兩個(gè)核心調(diào)節(jié)蛋白，它們相互作用能夠調(diào)節(jié)開花信號(hào)整合因子。FLC 是MADS-box 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要在芽尖和根尖表達(dá)［5］，在春化途徑中，F(xiàn)LC 起到關(guān)鍵的作用。擬南芥FLC 突變體和野生型都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的春化需求，春化處理后的擬南芥FLC 的表達(dá)水平降低，過表達(dá)FLC 會(huì)導(dǎo)致擬南芥開花延遲［6-7］。SVP 也是開花負(fù)調(diào)控蛋白，含有保守的MADS-box，它在植物的整個(gè)營養(yǎng)體生長階段中表達(dá)，維持營養(yǎng)生長階段，但在花序分生組織中幾乎不表達(dá)［8-9］。開花途徑整合因子Flowering Locus T(FT)、Suppressor of Overexpression of Constans 1(SOC1)的啟動(dòng)表達(dá)，能促進(jìn)植物開花［10-11］。而FLC 和SVP 蛋白既能在莖尖分生組織中抑制SOC1 基因轉(zhuǎn)錄，又能在幼葉中調(diào)節(jié)FT 基因表達(dá)，阻止FT 蛋白等開花信號(hào)從葉片向分生組織運(yùn)轉(zhuǎn)［12］。此外FLC 蛋白還會(huì)影響開花協(xié)調(diào)因子FLOWERING LOCUS D (FD)的表達(dá)，削弱分生組織對(duì)開花信號(hào)的響應(yīng)［13］。

在1年生的草本植物(如擬南芥、薺菜)中，開花抑制因子FLC 與SVP 已經(jīng)被克隆，且被證實(shí)存在特殊的相互作用［14-15］。然而在多年生的林木中，每年的繁殖期會(huì)消耗大量的能量，利用開花抑制因子延緩花期的研究尚未見報(bào)道。白樺(Betual platyphylla Suk.)又稱樺木，是我國東北地區(qū)的主要樹種。具有耐貧瘩、耐嚴(yán)寒、生長快等特性［16-17］。白樺全身都是寶。白樺的木材為家具及造紙?zhí)峁┰?，其樹皮、汁液等也富含多種寶貴的營養(yǎng)成份，是天然的保健藥品。為了延長白樺的營養(yǎng)生長時(shí)間，獲得高質(zhì)量的白樺材料，探究白樺的晚花機(jī)制至關(guān)重要。本文通過克隆白樺開花抑制因子BpFLC 和BpSVP 基因，并構(gòu)建酵母表達(dá)載體，從真核表達(dá)水平建立白樺FLC 與SVP 酵的母雙雜交體系，為深入分析白樺FLC 與SVP 間的作用域和互作位點(diǎn)的相互作用等提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白樺幼葉cDNA 由本實(shí)驗(yàn)室保存;E.coli DH5α感受態(tài)菌株購自天根生化科技有限公司(北京);酵母雙雜交表達(dá)載體pGBKT7、pGADT7，對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7- 53、pGBKT7 - lam、pGADT7 - T，酵 母 菌Y2Hgold，酵母省缺培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化試劑均購自Clontech 公司(日本);質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司(美國);PCR 相關(guān)試劑、DNA marker、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Nde I，T4 DNA ligase 連接酶購自TaKaRa 公司(日本);胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、YNB(無氨基酸酵母氮源)購自Amresco 公司(美國);所用引物合成、測(cè)序服務(wù)由博仕生物技術(shù)有限公司完成(哈爾濱);其他實(shí)驗(yàn)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 酵母誘餌載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

1.2.1 目的基因的克隆

根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)特異性引物，BLAST 分析排除異源基因同源性序列，引物序列見表1。以白樺幼葉cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 克隆。反應(yīng)體系:10×Ex PCR buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，Primer-F(10 μmmol/L)1 μL，Primer-R(10 μmmol/L)1 μL，ExTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，cDNA 模板2 μL，加ddH2O 至終體積25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃4 min;94 ℃30 s，58 ℃45 s，72℃1 min 共35 個(gè)循環(huán);72 ℃7 min。反應(yīng)完成后取3 μL 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 酵母誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR 產(chǎn)物利用純化試劑盒純化后，用Nde I和EcoR I 限制性內(nèi)切酶分別酶切目的片段和載體，酶切體系:Nde I 1 μL，EcoR I 1 μL，10×H buffer 2 μL，質(zhì)粒1 μg，加ddH2O 至終體積20 μL。在37 ℃水浴鍋中恒溫處理2.5 h。酶切完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳，用試劑盒膠回收酶切后的目的片段。然后進(jìn)行目的片段的連接重組，重組體系:10×T4 DNA ligase buffer 1 μL T4 DNA ligase 1 μL，目的片段6 μL，載體2 μL，終體積10 μL。16 ℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布含有卡那霉素(pGBKT7 載 體，Kana 50 μg/mL)或 氨 芐 霉 素(pGADT7 載體，Amp 50 μg/mL)的LB 平板培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)14～16 h。然后挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR，提質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR 和酶切鑒定，最后將陽性克隆送往博仕生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.3 酵母Y2Hgold 感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化

參考Clontech 公司Gold Yeast Two-Hybrid System 操作手冊(cè)及本實(shí)驗(yàn)室的改良法［18］，采用PEG/LiAc 法依次將重組質(zhì)粒pGBKT7-BpFLC 及pGBKT7-BpSVP 單獨(dú)分別轉(zhuǎn)化Y2Hgold 感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD/-Trp 單缺培養(yǎng)基。將pGBKT7-BpFLC/pGADT7-BpSVP 和pGBKT7-BpSVP/pGADT7-Bp-FLC 分別共轉(zhuǎn)入Y2Hgold 感受態(tài)細(xì)胞，平行設(shè)置空白載體對(duì)照試驗(yàn)。轉(zhuǎn)化完成后，分別涂布SD/-Leu/-Trp(DDO)二缺培養(yǎng)基。30 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，觀察轉(zhuǎn)化情況。

1.2.4 酵母誘餌載體的自激活及毒性檢驗(yàn)

在SD/-Trp 單缺培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取直徑大于2 mm 的單克隆，用50 μL 無菌水重懸后，分別轉(zhuǎn)移至SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp/(DDO)、SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal(TDO/X)、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA/X-α-gal(QDO/A/X)培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d 后觀察平板的生長情況及菌落顏色變化，來檢測(cè)誘餌蛋白有無自激活作用。

挑取經(jīng)檢驗(yàn)的直徑大于2 mm 的單菌落，分別接種與5 mL SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中，30 ℃230～250 r/min，震蕩培養(yǎng)12 h，將過夜菌液以1 ∶100 稀釋后接種于100 mL 的SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)后0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 后吸取菌液3 mL，以新鮮的SD/-Trp 液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，用可見光分光光度計(jì)在OD600處測(cè)定其吸光度，記錄酵母生長情況，分析誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞自身有無毒害作用。

1.2.5 雙雜交驗(yàn)證蛋白互作

SD/-Leu/-Trp 二缺培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取直徑大于2 mm 的單克隆，用50 μL 無菌水重懸后，進(jìn)行菌液PCR 檢驗(yàn)?zāi)康幕?。同時(shí)取2 μL 分別轉(zhuǎn)移至SD/-Leu/-Trp/(DDO)、SD/-Leu/-Trp/His(TDO)、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA(QDO/A)、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA/X-α-gal(QDO/A/X)培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d 后觀察平板的生長情況及菌落顏色變化。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 BpFLC 和BpSVP 基因的克隆及分析

從白樺幼葉cDNA 中成功克隆出白樺BpFLC和BpSVP 基因(圖1)。

圖1 白樺BpFLC 與BpSVP 基因的PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

其中BpFLC 基因(Gene bank 登錄號(hào):KC020112)的ORF 長度為627 bp，編碼208 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量和等電點(diǎn)分別為23.85 kDa 和9.04;BpSVP 基因(Gene bank 登錄號(hào):KP693588)的的ORF 長度為678 bp，編碼225 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量和等電點(diǎn)分別為25.25 kDa 和6.68。同源性分析結(jié)果表明BpFLC蛋白與可可樹TcFLC 相似度最高(76%)，BpSVP 蛋白與山核桃CcSVP 相似度最高(92%)，且SVP 蛋白的保守性高于FLC 蛋白。不同物種間的FLC 結(jié)構(gòu)域分析(http://pfam.sanger.ac.uk/)表明(圖2，3):白樺BpFLC 與BpSVP 均屬M(fèi)IKC 型蛋白。二者的M 域(MADS-box)均由51(9-59 aa，PF00319;E-value=4.9e-28)個(gè)氨基酸組成，K 結(jié)構(gòu)域(K-box)則分別由100(74-173aa，PF01486;E-value=1.5e-15)和104(69-172aa，PF01486;E-value=1.5e-15)個(gè)氨基酸組成。兩個(gè)蛋白M 域的保守性均高于K 域。信號(hào)肽預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)表明:BpFLC 與BpSVP 蛋白的N 端均不含信號(hào)肽，不屬于胞外分泌蛋白或膜蛋白。因此，將BpFLC 與BpSVP完整編碼框構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒，不會(huì)因?yàn)榉置诘鞍锥绊懙浇湍鸽p雜交系統(tǒng)中的蛋白相互作用檢測(cè)。

圖2 白樺BpFLC 蛋白同源序列比對(duì)分析

圖3 白樺BpSVP 蛋白同源序列比對(duì)分析

2.2 酵母誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

用Nde I 和EcoR I 對(duì)BpFLC、BpSVP 基因PCR產(chǎn)物、酵母空載體pGBKT7、pGADT7 同時(shí)進(jìn)行雙酶切后，用T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，分別獲得重組載體，暫命名為pGBKT7-BpFLC、pGBKT7-BpSVP、pGADT7-BpFLC、pGADT7-BpSVP。提取質(zhì)粒利用載體通用引物(見表1)進(jìn)行PCR 驗(yàn)證(圖4)及酶切檢驗(yàn)(圖5)，并對(duì)陽性質(zhì)粒送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明BpFLC 和BpSVP 基因已經(jīng)分別重組到酵母表達(dá)載體中，未發(fā)生堿基突變，至此酵母誘餌表達(dá)載體構(gòu)建完成。

圖4 酵母表達(dá)質(zhì)粒BpFLC 和BpSVP 基因的PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.3 酵母誘餌表達(dá)載體的自激活與毒性檢測(cè)

酵母轉(zhuǎn)化3 d 后觀察平板發(fā)現(xiàn)，誘餌載體和空載體對(duì)照都在SD/-Trp 上生長，菌落顏色為白色，且長勢(shì)良好。而DDO、TDO/X、QTO/A/X 平板上都未見菌落生長，說明酵母誘餌表達(dá)載體沒有自激活作用(圖6)。從單缺板上挑取的陽性克隆，與空載體的對(duì)照菌在SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中測(cè)定的OD600處的吸光度表明，兩者在OD600處的吸光度隨時(shí)間先增長后趨于穩(wěn)定，但兩者生長情況變化不顯著，整體生長趨勢(shì)相同，說明重組誘餌載體pGBKT7-BpFLC 和pGBKT7-BpSVP 對(duì)酵母自身沒有毒害作用(表2)。

圖5 酵母重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖6 酵母誘餌載體的自激活驗(yàn)證

表2 酵母誘餌蛋白載體的毒性檢驗(yàn)

2.4 雙雜交蛋白互作的驗(yàn)證

在酵母Y2Hgold 菌中分別共轉(zhuǎn)pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP 和pGBKT7-BpSVP×pGADT7-Bp-FLC 及空載體對(duì)照pGBKT7-BpFLC×pGADT7 和pGBKT7-BpSVP×pGADT7。結(jié)果表明(圖7)上述4種組合均能在DDO 平板上正常生長。進(jìn)一步試驗(yàn)表明，酵母雙雜交陰性對(duì)照Y2Hgold［pGBKT7-Lam×pGADT7-T］，Y2Hgold［pGBKT7-BpFLC×pGADT7］和Y2Hgold［pGBKT7-BpSVP×pGADT7］均不能在TDO、QTO/A、QTO/A/X 生長，說明它們不能激活下游的報(bào)告基因。而陽性對(duì)照Y2Hgold［pGBKT7-53×pGADT7-T］，Y2Hgold［pGBKT7-BpFLC×pGADT7-

BpSVP］和Y2Hgold［pGBKT7-BpSVP×pGADT7-Bp-FLC］均可以在TDO、QTO/A 平板上生長出菌落，說明在這3 個(gè)酵母中的報(bào)告基因HIS3、AUR1-C 和ADE2 都能夠被激活。此外，Y2Hgold［pGBKT7-Bp-FLC×pGADT7-BpSVP］還能夠在QDO/A/X 平板上生長，并且菌落呈藍(lán)色，而對(duì)照均不能生長(圖7)。由此表明:BpFLC 能夠與BpSVP 結(jié)合，啟動(dòng)了4 個(gè)報(bào)告基因HIS3、AUR1-C、ADE2、MEL1 的表達(dá)。兩個(gè)基因互換載體后，仍能激活上述4 個(gè)報(bào)告基因，說明白樺BpFLC 與BpSVP 存在相互作用。

3 結(jié)論與討論

在植物的生命周期中，由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變是至關(guān)重要的，“開花”是這個(gè)轉(zhuǎn)變的開關(guān)。生理學(xué)和遺傳學(xué)的分析表明開花是由多種環(huán)境因素和內(nèi)源因素共同作用的結(jié)果。開花調(diào)節(jié)途徑中的多種途徑共同調(diào)節(jié)開花途徑整合因子，促使頂端分生組織向生殖器官轉(zhuǎn)變［3-4］。本研究中從白樺中克隆的BpFLC 和BpSVP 基因均編碼MIKC 型蛋白，屬于開花抑制因子。根據(jù)在模式植物擬南芥中的研究表明，F(xiàn)LC 在春化途徑中起到至關(guān)緊要的作用，SVP 參與自主途徑、溫敏途徑和赤霉素途徑的調(diào)控［10，12，19］。這兩個(gè)開花抑制因子均能夠與開花促進(jìn)因子FT 和SOC1 的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平，從而延遲開花時(shí)間。最新研究表明一個(gè)非生物脅迫應(yīng)答基因MEE3 能夠結(jié)合FLC 的啟動(dòng)子區(qū)域，激活FLC 的表達(dá)［20］。此為還發(fā)現(xiàn)SVP 是在擬南芥的莖尖位置通過減少赤霉素合成來調(diào)控成花轉(zhuǎn)變的［21］。白樺BpFLC 和BpSVP 這2 個(gè)蛋白的MADS-box 都高度保守。K-box 的保守性相對(duì)較差［22-23］，經(jīng)過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)BpFLC 和BpSVP 均含有3 個(gè)連續(xù)的親水α 螺旋。Yang 等［24］對(duì)K-box 的研究表明，前2個(gè)α 螺旋可能在二聚體結(jié)構(gòu)形成中起決定性作用，但其識(shí)別的目標(biāo)序列的特異性位點(diǎn)仍然未知。

圖7 酵母中BpFLC 和BpSVP 之間相互作用

早期利用酵母雙雜交技術(shù)，將擬南芥AtFLC、AtSVP 基因連入酵母表達(dá)載體中，在AH109 中進(jìn)行雙雜交驗(yàn)證，結(jié)果表明AtFLC 和AtSVP 存在相互作用［14］。利用最新的轉(zhuǎn)錄組分析及免疫共沉淀結(jié)果也表明AtFLC 與AtSVP 存在直接的作用，且AtSVP也與AtAP1 存在相互作用［25-26］。湯青林等將十字花科的芥菜BjSVP 和BjFLC 也利用酵母雙雜交系統(tǒng)，在酵母菌中通過激活了酵母的4 個(gè)報(bào)告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1，證實(shí)芥菜BjSVP 和Bj-FLC 存在相互作用［15］。并且利用pET 原核表達(dá)系統(tǒng)，通過蛋白體外表達(dá)以及SDS-PAGE，檢測(cè)到芥菜BjSVP 和BjFLC 能形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物，推測(cè)BjSVP 和BjFLC 確實(shí)存在相互作用［27］。本文中白樺BpFLC 和BpSVP 酵母雙雜交體系的建立，為這二者間的作用結(jié)構(gòu)域和互作位點(diǎn)的篩選提供了一個(gè)可靠的技術(shù)平臺(tái)。雖然酵母雙雜交篩選高效、應(yīng)用廣泛，但它也存在固有的技術(shù)缺陷，如酵母屬低等真核生物，與高等生物體內(nèi)的蛋白翻譯、折疊與加工等生物過程存在差異;再者酵母雙雜交僅能檢測(cè)2 個(gè)蛋白間的結(jié)合，不能檢測(cè)多個(gè)蛋白間的相互作用;另外蛋白自身的自激活造成的假陽性及毒性、分泌性等假陰性結(jié)果也均限制了酵母雙雜交的應(yīng)用［28-29］。為了克服這一技術(shù)缺陷，采用其他原理的研究蛋白互作的技術(shù)，例如體內(nèi)免疫沉淀(Co-IP)或雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)，將會(huì)揭示蛋白在體內(nèi)的真實(shí)的互作情況，這些也是我們下一步的研究計(jì)劃，以進(jìn)一步確認(rèn)BpFLC 和BpSVP 之間在體內(nèi)是否存在互作。

綜上，本文首次從林木中克隆出開花抑制因子BpFLC 和BpSVP，并利用酵母雙雜交驗(yàn)證了BpFLC和BpSVP 存在直接的相互作用。本研究為下一步深入分析白樺FLC 與SVP 間的作用域和互作位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Mouradov A，Cremer F，Coupland G.Control of flowering time:interacting pathways as a basis for diversity［J］.Plant Cell，2002，14(Supplment):111-130.

［2］ Simpson G G，Dean C.Arabidopsis the rosetta stone of flowering time［J］.Science，2002，96:285-289.

［3］ Boss P K，Bastow R M，Mylne J S，et al.Multiple pathways in the decision to flower:enabling，promoting，and resetting［J］.Plant Cell，2004，16(Supplment):18-31.

［4］ Blázquez M A，Weigel D.Integration of floral inductive signals in Arabidopsis［J］.Nature，2000，404:889-892.

［5］ Sheldon C C，Conn A B，Dennis E S，et al.Different regulatory regions are required for the vernalization-induced repression of Flowering Locus C and for the epigenetic maintenance of repression［J］.Plant Cell，2002，14(10):2527-2537.

［6］ Michaels S D，Amasino R M.Flowering Locus C encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering［J］.Plant Cell，1999，11(5):949-956.

［7］ Sheldon C C，Burn J E，Perez P P，et al.The FLF MADS box gene:a repressor of flowering in Arabidopsis regulated by vernalization and methylation［J］.Plant Cell，1999，11(3):445-458.

［8］ Hartmann U，H?hmann S，Nettesheim K，et al.Molecular cloning of SVP:a negative regulator of the floral transition in Arabidopsis［J］.Plant J，2000，21(4):351-360.

［9］ Liu C，Zhou J，Bracha Drori K，et al.Specification of Arabidopsis floral meristem identity by repression of flowering time genes［J］.Development，2007，134(10):1901-1910.

［10］ Li D，Liu C，Shen L，et al.A repressor complex governs the integration of flowering signals in Arabidopsis［J］.Dev Cell，2008，15(1):110-120.

［11］ Giakountis A，Coupland G.Phloem transport of flowering signals［J］.Curr Opin Plant Biol，2008，11(6):687-694.

［12］ Lee J H，Yoo S J，Park S H，et al.Role of SVP in the control of flowering time by ambient temperature in Arabidopsis［J］.Genes Dev，2007，21(4):397-402.

［13］ Abe M，Kobayashi Y，Yamamoto S，et al.A bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex［J］.Science，2005，309:1052-1056.

［14］ Fujiwara S，Oda A，Yoshida R，et al.Circadian clock proteins LHY and CCA1 regulate SVP protein accumulation to control flowering in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2008，20(11):2960-2971.

［15］ 湯青林，李念祖，丁寧，等.芥菜開花調(diào)控蛋白SVP 與FLC 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及其相互作用研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2012，39(6):1175-1182.

［16］ 卞麗萍，岳金權(quán)，張國珍，等.不同地理種源速生白樺化學(xué)組分［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，38(10):12-14.

［17］ 李天芳，姜靜，楊傳平，等.我國白樺育種研究概況［J］.江蘇林業(yè)科技，2008，32(2):47-49.

［18］ 鄭唐春，臧麗娜，曲冠證，等.檉柳類鋅指基因ThZFL 酵母誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)驗(yàn)證［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(12):4-8，15.

［19］ Michaels S D，Amasino R M.Memories of winter:Vernalization and the competence to flower［J］.Plant Cell and Environment，2000，23(11):1145-1153.

［20］ Li C N，Zhou Y Y，F(xiàn)an L M.A novel repressor of floral transition，MEE3，an abiotic stress regulated protein，functions as an activator of FLC by binding to its promoter in Arabidopsis［J］.Environ Exp Bot，2015，113(5):1-10.

［21］ Andrés F，Porri A，Torti S，et al.SHORT VEGETATIVE PHASE reduces gibberellin biosynthesis at the Arabidopsis shoot apex to regulate the floral transition［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111(26):2760-2769.

［22］ Pelaz S，Gustafson Brown C，Kohalmi S E，et al.APETALA1 and SEPALLATA3 interact to promote flower development［J］.Plant J，2001，26(4):385-394.

［23］ Martinez Castilla L P，Alvarez Buylla E R.Adaptive evolution in the Arabidopsis MADS-box gene family inferred from its complete resolved phylogeny［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(23):13407-13412.

［24］ Yang Y，F(xiàn)anning L，Jack T.The K domain mediates heterodimerization of the Arabidopsis floral organ identity proteins，apetala3 and pistillata［J］.Plant J，2003，33(1):47-59.

［25］ Gregis V，Sessa A，Colombo L，et al.Short vegetative phase，and apetala1 redundantly control agamous during early stages of flower development in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2006，18(6):1373-1382.

［26］ Mateos J L，Madrigal P，Tsuda K，et al.Combinatorial activities of Short vegetative phase and flowering locus define distinct modes of flowering regulation in Arabidopsis［J］.Genome Biol，2015，16:31.

［27］ 湯青林，許俊強(qiáng)，宋明，等.芥菜開花信號(hào)整合子的兩個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子FLC 和SVP 相互作用的體外檢測(cè)［J］.園藝學(xué)報(bào)，2011，38(12):2317-2324.

［28］ Fields S.High throughput two hybrid analysis［J］.FEBS J，2005，272(21):5391-5399.

［29］ 馬晶，趙國強(qiáng)，朱含，等.酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)SK2 與RyR2 蛋白的相互作用［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，46(1):45-48.