莊英萍，陳洪章，夏建業(yè)，唐文俊，趙志敏

進入21世紀以來，礦石資源和能源不斷減少、環(huán)境污染日益嚴重，使傳統(tǒng)的化石經濟面臨巨大挑戰(zhàn)，能源危機、環(huán)境危機成為世界各國未來發(fā)展急需解決的重大問題。在此背景下，基于豐富生物質資源的生物技術因環(huán)境友好、資源可再生等特點越來越受到人們的關注，工業(yè)生物技術已成為世界各國爭相發(fā)展的重點，其中生物過程工程技術是生物技術產業(yè)化的關鍵，是聯(lián)系上游生物技術，如合成生物學、基因工程、代謝工程等與實際生物技術產業(yè)的重要技術支撐。我國《國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要 (2006?2020)》已將生物技術作為科技發(fā)展的五大戰(zhàn)略重點之一。2010年9月通過的《國務院關于加快培育和發(fā)展戰(zhàn)略性新興產業(yè)的決定》也將生物產業(yè)列入戰(zhàn)略性新興產業(yè)。體現(xiàn)了國家層面對工業(yè)生物技術產業(yè)發(fā)展的重視程度，在《“十二五”生物技術發(fā)展規(guī)劃》中將生物過程工程技術列為未來重點突破的核心關鍵技術之一，主要涉及在線檢測技術、過程優(yōu)化和控制技術、分離提取技術、反應器設計與制造技術等。

開展生物過程工程研究，有其獨特的意義：為應對日益嚴峻的資源和環(huán)境壓力，世界各國都致力于發(fā)展高效綠色的生物方法與技術，以期代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學方法與技術制備大宗工業(yè)品，生物催化 (轉化) 是生物法制備工業(yè)品的核心，而生物催化 (轉化) 過程工程則是生物催化(轉化) 技術面向產業(yè)化的紐帶和基礎，是實現(xiàn)工業(yè)品制造綠色化、高效、低耗的關鍵；另外，在實驗室搖瓶中已基本可全化學合成基因組，并“半合成”人工細胞或“最小化細胞” (Minimal cell)，亦可用生物方法合成在自然界里不存在的新物質，然而，從實驗室人工細胞或最小化細胞到工業(yè)應用，還有許多基礎問題、尤其是生物過程工程技術方面的問題有待解決，如人工或最小化細胞在生物反應器中的適應性，如何以低成本進行大規(guī)模培養(yǎng)等等，這些問題都是生物過程工程所要解決的；另一方面，我國是一個工業(yè)生物技術產業(yè)大國，但并非強國，尤其在工業(yè)生物過程工程研究方面與國外有較大的差距，導致工業(yè)生產效率低下、污染和能耗大；另一方面，我國在現(xiàn)代生物技術方面發(fā)展迅猛，尤其近年在利用動物細胞生產抗體、疫苗、蛋白藥物的生物技術發(fā)展迅速，而與之配套的生物過程技術、裝備與先進國家存在較大差距，使得產業(yè)化效率低、產品質量差等，極大地限制了我國這一產業(yè)的發(fā)展勢頭。因此，在大力發(fā)展工業(yè)生物技術過程中，除了要在組學研究、合成生物學研究這些“高精尖”前沿技術方面取得突破外，更不能忽視過程工程在其成果產業(yè)化過程中所起的關鍵作用。

生物過程工程研究有其獨特之處：生物過程的主體是細胞的生命代謝，是一個復雜的系統(tǒng)，由于生物過程在反應器內進行，反應器內生物系統(tǒng)的表型取決于外界環(huán)境條件與細胞生理功能的共同作用，這種外界環(huán)境對細胞功能的影響可以通過不同途徑發(fā)生作用，是一個非常復雜的過程。因此為了更好地進行過程工程研究，人們必須考慮到以下幾個方面：應該研究細胞和反應器兩個系統(tǒng)的特性；研究過程中要堅持基礎研究、關鍵共性技術與產品應用技術一貫制研究，實現(xiàn)科學與工程的良好結合；生物過程研究的方式、規(guī)范、戰(zhàn)略都要轉變，以適應生物過程大數(shù)據時代的到來；注重生物過程工程研究中的多學科交叉，多學科知識將是支撐過程工程研究的基礎；過程工程研究，必須做到形成工藝工程裝備一體化研究技術體系，才能支撐工業(yè)生物過程的高效產業(yè)化。

我國的工業(yè)生物過程工程研究自 20世紀80年代以來，受國際上研究發(fā)展趨勢及我國工業(yè)生物技術的國情影響，先后經歷了多個發(fā)展階段：即早期從經典的化工過程研究中演變來的動力學研究方法；基于過程控制的優(yōu)化方法；基于過程單參數(shù)、多參數(shù)相關及先進傳感技術的多尺度過程優(yōu)化；固態(tài)發(fā)酵機理及基于機理的高效固態(tài)發(fā)酵反應器的設計等多個發(fā)展階段。本文主要從以上幾個方面綜述我國自開展生物過程研究以來的發(fā)展歷程，并通過分析指出未來生物過程工程研究的方向及重點。

1 依托傳統(tǒng)化工過程的研究方法的發(fā)展

1.1 基于過程動力學的生物過程研究

在工業(yè)生物過程研究的早期，一方面大部分生物過程研究的科學工作者主要從化工領域研究背景轉移過來的；另一方面國際上也是這種狀況，人們對工業(yè)生物過程的研究更多的是借鑒化工過程研究的手段，試圖通過開展過程動力學研究來解決工業(yè)生物過程工程控制的問題，此類研究在 20世紀90年代最為活躍，主要是通過非結構化的動力學模型來描述生物過程。此方法中將細胞看成黑箱，用經驗公式來描述細胞生長動力學、底物消耗動力學等，取得了一定進展，但是從生物過程復雜性來說，還不能完全采用類似的方式來實現(xiàn)生物過程的優(yōu)化控制。這方面的研究主要集中在批培養(yǎng)發(fā)酵的過程動力學模型的建立與驗證，固定化細胞的過程動力學等。

早期對過程動力學的研究主要集中在分批發(fā)酵動力學數(shù)據的分析和參數(shù)求取上，例如龔建華等[1]通過分析實驗數(shù)據，整理構建了用于描述賴氨酸分批生長的動力學模型，并利用該模型分析了底物消耗在產物、菌體及維持上的分配問題；施源等[2]利用數(shù)學建模分析了不穩(wěn)定質粒重組酵母菌的過程動力學，通過數(shù)值模擬可實現(xiàn)對發(fā)酵過程控制使重組乙型肝炎表面抗原產量提高20%；龔建華等[3]通過分批動力學模型參數(shù)Ks值設計補料培養(yǎng)方案，從而使大腸桿菌胞內β-半乳糖苷酶累計量明顯增加。邱宏偉等[4]針對短梗霉多糖發(fā)酵過程，建立了基于邏輯方程和 Lucdeking-Piret方程的動力學模型。宮衡等[5]、方柏山等[6]通過對賴氨酸發(fā)酵動力學研究，并利用補料批培養(yǎng)[7]等操作達到高的轉化率、生產強度極高的產物濃度。此外在動力學研究過程中，還發(fā)展出了相應的用于模型參數(shù)估計的單純形法[8]以及用于模型類型分類的比生長速率雙相法等相應的數(shù)值化建模支撐方法。此外，在固定化細胞動力學研究方面，也先后發(fā)表過多篇研究論文[9-10]。

隨著動力學研究的不斷深入，人們開始意識到傳質過程對動力學影響在工業(yè)生物過程研究中的重要性，從而在此方面進行了深入研究。王志龍[11]考察了傳遞過程對 Monod方程的影響，得出了傳遞過程不影響Monod方程的形式，但影響其動力學參數(shù)的求取。朱忠奎課題組[12]建立了固定化纖維素酶的反應動力學模型，系統(tǒng)地研究了產物競爭性抑制、內擴散限制、溶液中的宏觀底物濃度、載體大小等因素對球形載體內部的底物、產物濃度分布和效率因子的影響。其研究表明適當降低微球載體粒徑、提高反應體系中底物溶液濃度、改變載體的結構使底物在載體內部容易擴散等措施可以降低底物擴散限制對固定化纖維素酶促反應的影響。陳堅課題組[13]應用改進的 Logistic和Luedeking-Piert方程分別對細胞生長動力學和谷胱甘肽合成動力學進行了模擬，得到不同溫度下各種動力學參數(shù)。其結果表明較高溫度可以適當降低底物對細胞生長的抑制作用，谷胱甘肽合成與細胞生長呈現(xiàn)部分相耦聯(lián)關系。該模型為產朊假絲酵母Candida utilis發(fā)酵生產谷胱甘肽的過程控制提供了很好的理論依據。

相較于 20世紀90年代的模型優(yōu)化，近幾年的模型化或基于動力學模型的優(yōu)化往往具有更大的復雜度，并且應用的范圍也更加廣闊，發(fā)酵產品也更為豐富。為不熟悉的產品建立其生物過程的動力學模型已經成為了一種常規(guī)的研究手段。張建國等[14]利用分批發(fā)酵研究了靈芝Ganodermalucidum胞外多糖的合成特性，結果表明靈芝多糖合成和菌體生長呈部分生長關聯(lián)性。根據分批發(fā)酵試驗結果采用 Logistic方程、Luedeking-Piret方程和類似Luedeking-Piret方程，得到了描述靈芝生長、胞外多糖以及葡萄糖底物消耗分批發(fā)酵動力學模型。在初始葡萄糖變化較大范圍內，試驗數(shù)據與模型預測值進行了比較擬合，平均相對誤差小于5%，表現(xiàn)出很好的適用性。魯明波等[15]對法夫酵母的不同補料發(fā)酵方式進行了研究?；诘孜镆种颇Ｐ停岢隽艘环N優(yōu)化的兩階段補料策略，用于法夫酵母產蝦青素的高密度發(fā)酵，與傳統(tǒng)的補料方式相比發(fā)酵終點細胞干重達到23.8 g/L，蝦青素產量達到 29.05 mg/L，分別比分批發(fā)酵提高了52.8%和109%。

1.2 基于過程控制的模型化方法研究

隨著動力學研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)生化過程的模型化存在著諸多困難。首先，微生物細胞內存在著由上千個生化反應所組成的代謝網絡，很難將每一個反應的動力學模型整合起來描述細胞生物過程；其次，在微生物細胞代謝網絡基礎上還存在著不同水平上的調控機制，如酶動力學水平上的快速調控，酶轉錄表達水平上的遲緩調控等，這些過程的時間尺度存在很大跨度，因而也很難在一個統(tǒng)一的模型中表征；最后，微生物細胞內與胞外存在各種物質的輸運過程，這些過程的模型化描述也存在困難?；诖耍瑐鹘y(tǒng)的非結構化的動力學模型往往表現(xiàn)出精度低、應用范圍窄而受到了很大限制。由此逐漸發(fā)展起來了基于人工神經網絡、遺傳算法等過程建模方法。這種方法在生物過程研究即工業(yè)生物過程控制中一經引用，受到廣泛重視，也為工業(yè)生物過程的優(yōu)化控制發(fā)展起到了一定推動作用。

陳敏等[16]在鋅酵母分批流加發(fā)酵動態(tài)優(yōu)化過程研究中，將模式識別在鋅酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化控制中應用[17]，嘗試將模糊集和模式識別的理論和方法引入發(fā)酵過程研究中，以鋅酵母發(fā)酵工藝條件優(yōu)化為目的，獲得了酵母產量的提高，糖轉化率高及殘?zhí)菨舛鹊偷戎T因素的綜合考慮優(yōu)化控制區(qū)。蔡煜東等[18]率先在谷氨酸發(fā)酵過程的神經網絡模擬預測模型，利用人工神經網絡典型模型反向傳播模型，初步嘗試了神經網絡模擬預測方法的效果。苗志奇等[19]則利用神經網絡優(yōu)化對谷氨酸流加發(fā)酵過程進行研究，將模擬網絡與優(yōu)化網絡結合組成雙網系統(tǒng)，用于谷氨酸流加生產過程的模擬與優(yōu)化分析。楊一兵等[20]則發(fā)展了基于神經網絡的生化過程預估優(yōu)化控制，并以工業(yè)生產中發(fā)酵過程的補料控制為例，敘述了神經網絡模型如何用于生化過程預估和優(yōu)化控制。方柏山等[21]在青霉素補料批培養(yǎng)過程研究中利用了人工神經網絡模型。近些年人工神經網絡在生物過程工程研究中進一步深化，袁景淇課題組[22]利用基于人工神經網絡的滾動學習預報技術，實現(xiàn)了對罐批產量的預報，并結合其他信息，如pH、二氧化碳產生量等，對異常原因進行判斷，并結合效益函數(shù)實際值和預報曲線異常類型，來判定停罐和安排車間調度或者采取其他措施，實現(xiàn)損失的降低。譚左平等[23]針對試驗數(shù)據含有的噪音導致的模型預測精度和泛化能力下降的問題，提出了一種新的基于熵準則的 RBF神經網絡建模方法，并成功運用在谷胱甘肽發(fā)酵過程建模中。實驗結果表明，該方法具有較高的預測精度、泛化能力和良好的魯棒性，從而對谷胱甘肽的發(fā)酵建模有潛在的應用價值。

除了人工神經網絡模型外，遺傳算法、自適應控制理論、在線參數(shù)辨識、多變量自校正控制以及支持向量機等方法得到了充分發(fā)展和應用。禹慧明等[24]將遺傳算法在工程優(yōu)化中的應用，以及遺傳算法對生物科學的可能應用作了簡單的展望。金沙等[25]利用在線參數(shù)辨識，構建了帶有噪音的適合于工業(yè)規(guī)模青霉素半連續(xù)發(fā)酵數(shù)學模型，以排氣的二氧化碳釋放速率為在線觀測量，應用推廣卡爾曼濾波器進行狀態(tài)與參數(shù)的在線辨識，為過程的自適應優(yōu)化控制奠定了基礎。在此基礎上進一步利用自適應控制理論[26]，構造了青霉素半連續(xù)發(fā)酵跟蹤自適應控制系統(tǒng)。葉開明等[27]采用多變量自校正控制，以青霉素補料批發(fā)酵為例，采用兩階離散動態(tài)模型描述生化反應過程的動態(tài)行為，借助于計算機在線監(jiān)測系統(tǒng)，在40 000 L大罐上進行參數(shù)辨識與多變量自校正控制仿真研究。魏東芝等[28]將增廣卡爾曼濾波器在維生素C二步發(fā)酵中應用，在維生素C二步發(fā)酵動力學模型研究的基礎上，引進增廣Kalman濾波器理論，將數(shù)學模型、發(fā)酵系統(tǒng)和實際操作等因素引起的偏差歸為白噪聲序列，用于發(fā)酵狀態(tài)及模型參數(shù)的濾波處理。結果表明，濾波估計比模型計算的擬合精度大為提高，加深了對該系統(tǒng)動力學特性的認識，為維生素 C二步發(fā)酵過程的狀態(tài)估計、狀態(tài)預測及在線辨識奠定了理論基礎。劉毅等[29]采用最小二乘支持向量機以Pensim仿真平臺為例對青霉素發(fā)酵這一典型生化過程進行建模研究。給出了最小二乘支持向量機參數(shù)的調整策略和分析結果，建立了產物濃度、菌體濃度和底物濃度等重要過程變量的在線預報模型，其結果表明用其建立的在線預報模型擬合誤差小、推廣性能好，可以作為發(fā)酵過程的進一步控制和優(yōu)化的參考依據。

2 基于過程參數(shù)相關性分析的過程多尺度研究

2.1 單因素水平的過程優(yōu)化研究

在單因素水平上進行過程優(yōu)化研究在過程研究早期具有較多的文獻報道，主要通過研究諸如攪拌轉速、通氣流量、前體添加濃度、金屬離子添加濃度等從單一水平上靜態(tài)研究初始添加量等對過程的影響，這方面的研究由于忽略了發(fā)酵過程的動態(tài)變化因而僅在一定程度上起到過程優(yōu)化的目的，但是由于操作簡單易于理解而被廣泛應用。

李彤等[30]對 L-亮氨酸發(fā)酵過程氮源反饋與非反饋控制的初步研究，比較了幾種非反饋型、反饋型不加硫酸銨的發(fā)酵結果，提出了最佳的控制方法。方宏清等[31]在雙價基因工程大腸桿菌的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)工藝研究中，以氧傳遞系數(shù)為放大準則成功地將該工藝在 200 L國產發(fā)酵罐上再現(xiàn)。李寅等[32]通過高發(fā)酵活力面包酵母的高產率流加培養(yǎng)策略研究，考察了不同的流加策略對面包酵母培養(yǎng)過程中發(fā)酵活力和產量的影響。并且進一步研究了酵母搖瓶發(fā)酵中pH、裝液量、初糖濃度、碳氮磷比等單因素對谷胱甘肽發(fā)酵的影響[33]。

楊蘊劉課題組[34]就戊二酸-7-氨基頭孢烷酸(GL-7ACA) ?；富蚬こ叹难a糖方式進行了優(yōu)化研究，分別對恒速流加、pH反饋控制和指數(shù)流加等 3種補糖模式進行了考察，發(fā)現(xiàn)以指數(shù)流加方式得到的生物量和產酶水平最高，而從基因的表達效率即比酶活看，pH反饋的補料方法最優(yōu)，以上研究為GL-7ACA?；傅墓I(yè)化生產提供了很好的線索。詹曉北課題組[35]通過考察pH控制對熱凝膠發(fā)酵的影響，把熱凝膠發(fā)酵過程分成兩階段，菌體生長期pH恒定控制在 7.0，熱凝膠合成期 pH恒定在 5.6，可以得到最大的熱凝膠產量、生產強度及轉化率。譚天偉課題組[36]通過優(yōu)化前體L-蛋氨酸的量以及補加策略，使 S-腺苷-L-蛋氨酸的量(S-adenosyl methionine, SAM) 的最高積累量達到4.98 g/L，生物量132 g/L。徐志南等[37]考察了不同流加方式對重組大腸桿菌胞外人表皮生長因子 (hEGF) 的影響，發(fā)現(xiàn)與間歇式發(fā)酵相比，分批補料、在線識別流加和恒速流加均能有效地提高工程菌的質粒穩(wěn)定性和含質粒細胞的濃度，同時hEGF的體積濃度分別提高了28.1%、25.5%和 150%，表明恒速流加最適于 hEGF的表達。陳堅課題組[38]研究了不同溫度下谷氨酰胺轉氨酶 (Microbial transglutaminase, MTG)分批發(fā)酵的過程動力學特性，提出了分批發(fā)酵生成MTG的分階段溫度控制策略。諸葛健課題組[39]研究了供氧對假絲酵母產丙三醇的研究，發(fā)現(xiàn)適量供氧能得到高丙三醇產率，而產生少量的副產物。陳堅課題組[40]研究了金屬離子對地衣芽胞桿菌合成多聚 γ-谷氨酸的影響，表明Mn2+、Co2+、Zn2+均能促進多聚 γ-谷氨酸的合成。劉同軍等[41]研究了溶氧對變溶菌素發(fā)酵的影響，表明在最適條件下，不同發(fā)酵階段，氧的供求情況總在發(fā)生變化。邱英華等[42]研究了溶氧對殺菌肽-X發(fā)酵工藝的影響，發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)過程處于限制狀態(tài)時最適于工程菌的表達。陳堅課題組[43]研究了 pH對產朊假絲酵母分批發(fā)酵生產谷胱甘肽的影響，發(fā)現(xiàn)在pH為5.5時谷胱甘肽總產量最高。焦鵬課題組[44]研究了二元酸發(fā)酵過程中，烷烴的加入時間對細胞生長、P450酶的誘導和產酸的影響，并以此建立了長鏈二元酸新的發(fā)酵工藝。

隨著對生物過程理解的加深，生物過程研究不再局限于微生物發(fā)酵生產生物質，其過程優(yōu)化也逐漸拓展到各個領域。細胞工廠概念的深入人心，使得過程優(yōu)化的策略被大量用于異源表達的生物過程中。聶艷秋等[45]利用葡萄糖作為底物，以經過加熱預處理并活化的厭氧污泥作為種泥，研究了其初始pH值對產氫產乙酸/耗氫產乙酸兩段耦合工藝厭氧發(fā)酵定向生產乙酸的影響，并按照初始pH的不同對發(fā)酵過程進行了分類，為利用污泥生產乙酸的生物過程提供了優(yōu)化結果。

2.2 基于統(tǒng)計的過程優(yōu)化方法研究

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化往往是生物過程優(yōu)化的開端，而在20世紀90年代出現(xiàn)的基于正交實驗、均勻設計等的培養(yǎng)基實驗設計方法極大提高了培養(yǎng)基優(yōu)化的實驗設計方面的效率。另外在此基礎上逐漸發(fā)展起來的響應面分析、析因實驗等得到快速發(fā)展，成為培養(yǎng)基優(yōu)化的一種非常高效的方法而被廣泛使用。

在紅霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化研究中，范代娣等[46]通過正交實驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，抗生素生物合成提高了15%?29%。劉黨生等[47]應用均勻設計對 L-異亮氨酸發(fā)酵進行了培養(yǎng)基優(yōu)化。方柏山等[48]用人工神經網絡模型描述發(fā)酵培養(yǎng)基與產物的關系，并由此模型預測產物濃度，用遺傳算法優(yōu)化培養(yǎng)基配方能夠收到較好的效果，它不僅能有效地提高產物濃度、顯著地降低培養(yǎng)基成本，而且可大大減少繁瑣的實驗工作量及縮短研究周期。李孱等[49]用響應面法對乳酸鏈球菌Lactococcus lactis生產細菌素乳鏈菌肽的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，使乳鏈菌肽產量增加了一倍。張博潤課題組[50]通過單因素實驗和正交試驗設計優(yōu)化高生物量富硒酵母培養(yǎng)條件，使硒含量達到了優(yōu)化前的1.3倍。夏黎明課題組[51]利用正交實驗，優(yōu)化了假絲酵母發(fā)酵玉米芯半纖維素水解液生產木糖醇的工藝條件，并結合發(fā)酵過程中通氣量的優(yōu)化使得最終的木糖醇得率達到0.75 g/g。張厚瑞等[52]采用二次正交旋轉組合設計研究了蔗渣半纖維素水解過程中硫酸濃度與液/固比對木糖收率的影響。王普等[53]通過菌種優(yōu)選得到產高選擇性羰基還原酶的熱帶假絲酵母104 菌株，可不對稱還原 1-(3,5-二三氟甲基) 苯基乙酮生成 (S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇，并利用部分因子實驗設計、最陡爬坡實驗、中心組合實驗以及響應面分析的方法確定了最優(yōu)化的培養(yǎng)基成分，提高了 65.2%的還原酶活力。申乃坤等[54]利用耐高溫酵母菌株對木薯粉同步糖化法生產高濃度乙醇的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，最終利用響應面優(yōu)化的方法優(yōu)化培養(yǎng)基組成和操作參數(shù)，使得最終產量提高了33%。

2.3 基于在線傳感技術的多參數(shù)相關分析及過程多尺度研究

過程的動態(tài)分析涉及到過程中代謝過程的代謝轉化機理，自 20世紀90年代以來，從先進過程在線監(jiān)測技術的研究到過程參數(shù)的相關分析，從反應器尺度觀察到的各種參數(shù)的動態(tài)變化來解讀胞內代謝的情況，從而對過程進行優(yōu)化與控制，取得了很好的工業(yè)應用成果。

生物反應過程是細胞在生物反應器中大規(guī)模培養(yǎng)的反應過程，其中活體細胞的代謝調控是過程優(yōu)化與放大的關鍵。張嗣良課題組[55-57]提出了生物反應過程多尺度理論：可將生物反應過程分為基因分子尺度、細胞尺度與生物反應器尺度的網絡結構；生物反應過程中具有不同尺度的網絡狀態(tài)的輸入輸出關系，存在著信息流、物質流與能量流，具有很寬的空間尺度和時間尺度；基因水平的分子尺度屬于納尺度范圍，一般在10–9m以下，細胞代謝屬于微尺度范圍，在10–8?10–4m之間，反應器工程屬于介尺度范圍，在 10–3?102m之間。微生物和細胞在酶活性水平上 (包括酶的激活、抑制、亞基的結合和解離、共價修飾和降解) 控制的時間常數(shù)在毫秒至秒的范圍內；在基因表達調控水平上 (誘導、轉錄的阻遏和去阻遏) 描述至分鐘；而在種群選擇和進化水平上則描述至天或更長的時間單位。因此還必須在這些不同時間尺度范圍內進行動態(tài)或定態(tài)的相關研究，生物反應過程優(yōu)化不能只是從單一尺度 (基因、細胞、生物反應器) 上去解決，而是要注意它們之間的關系和瓶頸問題，其中跨尺度觀察與控制是微生物過程優(yōu)化的關鍵。由此形成了一套基于參數(shù)相關的發(fā)酵過程多尺度問題研究的優(yōu)化技術和發(fā)酵過程多參數(shù)調整的放大技術。

隨著生物技術發(fā)展，人們對微生物細胞內的代謝網絡的研究越來越清晰，逐漸出現(xiàn)的基因尺度代謝網絡模型構建、基因組學、蛋白組學、代謝組學等飛速發(fā)展，使得生物過程工程研究也逐漸由胞外宏觀代謝特性研究逐步深入到胞內代謝流特性研究，例如穩(wěn)定性同位素13C標記的胞內代謝流分析技術等的發(fā)展正逐漸將生物過程工程研究推上一個新的高度。

陳昭烈課題組[58]以 HEK293細胞團的粒徑、細胞數(shù)、細胞活力、葡萄比消耗率、乳酸轉化率為觀察指標，考察了攪拌轉速對細胞團形成、粒徑分布以及細胞生長和代謝的影響，表明合適的攪拌速度所產生的流體剪切力既能合理控制細胞團的大小，也可以為細胞團中HEK293細胞提供基本的物質傳遞效率滿足其正常生長和代謝。張嗣良課題組[59]在鳥苷發(fā)酵過程研究中，通過對發(fā)酵過程多參數(shù)的相關性分析，結合生物合成代謝途徑、氨基酸和有機酸積累的分析，確認了發(fā)酵過程代謝流從HMP向EMP 途徑的遷移，認為造成這種代謝流遷移的原因可能是過程銨離子積累，在此基礎上，通過對過程參數(shù)實時檢測分析和及時調整EMP和 HMP 代謝通量，使鳥苷產率提高了 35%。張嗣良課題組[60]在金霉素發(fā)酵過程研究中，通過對加油后DO和OUR等參數(shù)變化的相關性分析，客觀、動態(tài)地把握臨界氧水平及氧平衡的制約因素。譚天偉課題組[61]研究了麥角固醇發(fā)酵過程中DO、OUR、pH和殘?zhí)菨舛扰c釀酒酵母的生物量和麥角固醇含量的關系，并研究了這些參數(shù)之間的內在聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)溶氧是關鍵敏感參數(shù)，將其控制12%左右能有效提高單位體積發(fā)酵液中麥角固醇的產量。郭美錦等[62]將重組畢赤酵母表達工程植酸酶過渡相的在線和離線參數(shù)進行相關性分析，建立了過渡相在線參數(shù)pH、OUR (Carbondioxide eliminationg rate, CER)和RQ與胞內代謝通量變化的關系，為跨尺度觀察發(fā)酵過程變化及其控制提供了數(shù)據依據。喻揚等[63]利用氧化還原電極，研究了在厭氧條件下將氧化還原電位值 (Oxidation reduction potential, ORP) 控 制在不同水平 (–50 mV,–100 mV, –150 mV, –230 mV) 對乙醇發(fā)酵過程的影響，實現(xiàn)了通過氧化還原電位來監(jiān)控厭氧發(fā)酵過程特性，為今后厭氧條件或極低溶氧濃度的好氧發(fā)酵過程的參數(shù)采集提供了方法，也為酵母細胞合理分配代謝流，實現(xiàn)乙醇生產最優(yōu)化的宏觀控制提供了一種有效的手段。汪建峰等[64]利用合成生物學構建了表達萜類化合物的大腸桿菌菌株，并建立了高效的MEP途徑用于萜類前體的合成，開展了新構建菌株的高密度發(fā)酵研究，通過補糖速率調控，使紫槐二烯的產量從2.5 g/L提高到了6.1 g/L。鄒祥等[65]通過對實驗室規(guī)模紅霉素發(fā)酵過程的研究，在50 L規(guī)模反應器上優(yōu)化了復合培養(yǎng)基中氮源的種類及濃度，使最終的紅霉素有效組分產量提高22.2%；同時利用過程中跨尺度的研究，掌握了氮源對于紅霉素生產優(yōu)化的機理，并成功地在132 t及372 t工業(yè)規(guī)模生物反應器上實現(xiàn)了高產率的重現(xiàn)。李昆太等[66]利用小規(guī)模搖瓶實驗確定了環(huán)境pH對于維生素B12合成的顯著影響及作用機理，通過對過程中碳源及甲基供體的調控，使得維生素 B12的產量得到了顯著提升，并最終在120 t工業(yè)規(guī)模反應器上實現(xiàn)了pH在 7.15至 7.30之間的精確控制，得到了214.3 mg/L的最高產量。此后，王澤建等[67]探究了在維生素 B12的生產過程中氧氣消耗與產量間的關系，提出了“階梯降低”O(jiān)UR控制的策略，并成功應用在工業(yè)規(guī)模的120 t生物反應器上，最終達到了208 mg/L的穩(wěn)定產量。

3 固態(tài)發(fā)酵過程的研究發(fā)展

3.1 固態(tài)發(fā)酵及其與液態(tài)深層發(fā)酵的比較

固態(tài)發(fā)酵起源于中國，但因對固態(tài)發(fā)酵本質研究較少，導致其在相當長的時期里發(fā)展緩慢。與典型的深層液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵基質的含水量低，在12%?80%之間，大多為60%左右，這就使得固態(tài)發(fā)酵的有機廢水相當少，在當前環(huán)境污染日益嚴重的形式下，顯現(xiàn)出更大的優(yōu)勢。表1比較了固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵。

3.2 固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢

相比于液態(tài)發(fā)酵，供氧充足是固態(tài)發(fā)酵的顯著優(yōu)勢。此外，固態(tài)發(fā)酵產生的有機廢水少，產物濃度高；固態(tài)發(fā)酵更貼近絲狀真菌的天然生境，許多霉菌在固態(tài)發(fā)酵條件下生產能力更強。固態(tài)發(fā)酵可利用大量價格低廉的工、農業(yè)廢棄物生產高附加值產品，因而固態(tài)發(fā)酵被認為是可再生性資源綜合利用最有希望的途徑之一。目前，固態(tài)發(fā)酵被廣泛應用于食品釀酒、醫(yī)藥化工、能源環(huán)境等領域，表 2列舉了固態(tài)發(fā)酵產品的范圍及其發(fā)展歷程。

表1 固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵的比較[68-69]Table 1 Comparisons between solid-state fermentation with liquid fermentation[68-69]

表2 固態(tài)發(fā)酵產品發(fā)展歷程[70]Table 2 Development of solid-state fermentation products[70]

3.3 現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵的模型及調控

發(fā)酵過程的調控是實現(xiàn)過程優(yōu)化的重要途徑，也是提高固態(tài)發(fā)酵生產效率的主要方式。發(fā)酵過程控制需要詳細了解微生物的生物學特性，定量分析相關代謝網絡，運用工程學的知識對環(huán)境變量進行調控。固態(tài)發(fā)酵工程調控是以目標產物最大化為目的，通過認知、改變微生物的遺傳代謝特性，調節(jié)、改善發(fā)酵條件 (如反應器類型、操作變量等)，使微生物的生產潛能得到最大發(fā)揮的過程。本節(jié)主要從過程工程的角度出發(fā)，著重探討固態(tài)基質熱、質傳遞的宏觀模擬及調控進展。固態(tài)發(fā)酵宏觀建模針對基質床及其周圍環(huán)境之間的熱、質傳遞過程，主要用于評估反應器的適用性，優(yōu)化工藝操作變量。模型所包含的傳遞項大體相同，主要有基質內代謝熱的產生、熱傳導、熱對流、水蒸氣的產生和擴散；基質與反應器之間的空隙內熱量的傳導和對流，氣體的擴散，水蒸氣的擴散和凝結；以及反應器壁面與周圍環(huán)境之間發(fā)生的熱傳導和對流[71]。

20世紀80年代末和90年代初的固態(tài)發(fā)酵模型主要針對淺盤固態(tài)發(fā)酵和轉鼓式固態(tài)發(fā)酵[72]，運用微分方程，研究熱量、氣體、生物量等隨時間的變化，而沒有考察其在空間維度上的區(qū)別。與此同時，最初的模擬主要揭示蒸發(fā)散熱和通風操作對基質熱量散失的作用。90年代中期發(fā)展的淺盤固態(tài)發(fā)酵模型開始使用偏微分方程[73]，揭示了固態(tài)發(fā)酵過程中熱、質傳遞的變化。此時的模型在之前的基礎上有了較大發(fā)展，不僅將熱、質傳遞耦合，還考慮了菌體在基質表面生長對基質顆粒尺寸、孔隙和氧氣擴散速率的影響。不足之處在于，模型將基質顆粒和顆粒間隙都視為規(guī)則的形狀，這與實際情況仍然有較大偏差。但是這時期的模型在物理意義上已經較為符合實際，理論分析更為完備，為后來建模工作的發(fā)展提供了有益的參考[68-69]。

20世紀90年代后期，關于各類填充床反應器的宏觀模型層出不窮。此時的模型沿用了偏微分方程來強調發(fā)酵過程中基質熱傳導的不均一性，但忽略了填充床反應器中必然存在的蒸發(fā)散熱和強對流現(xiàn)象，模型并未體現(xiàn)熱、質傳遞的耦合。與此同時，模型也假設基質顆粒及顆粒間隙的形狀是規(guī)則的，未能克服對基質顆粒假設過于理想化的弊端。到20世紀90年代末，Smith等模型的出現(xiàn)有效緩解了上述問題。盡管其模型仍然假設基質顆粒形狀是規(guī)則的，但其將水蒸氣、氧氣的擴散和水分含量的變化同菌體生長和熱量傳遞相耦合；同時對菌體生長模型進行了改進，使其能夠體現(xiàn)菌體衰亡；值得一提的是，該模型還體現(xiàn)了基質的三相性和多孔性，且揭示了孔隙度隨發(fā)酵過程中基質含水量的變化呈動態(tài)分布[74-76]。因此，Smith等的模型從整體上更符合實際情況，較以往的固態(tài)發(fā)酵模型有著質的突破。該模型的缺陷在于忽略了由于菌體對基質顆粒的消耗利用所造成的基質物理性質變化。

21世紀初，人們逐漸認識到填充床發(fā)酵過程中床層壓降增大和軸向溫差是限制其規(guī)模放大的主要因素[77]。攪拌操作及與其具有相似機理的轉鼓反應器獲得重視，這時已經可以通過數(shù)值模擬從熱、質傳遞機理方面優(yōu)化反應器的操作變量。相關模型的研究主要關注剪切力對基質的混勻作用、破壞作用，考察基質的多孔性及氣、液、固各相內的熱、質傳遞，使發(fā)酵傳遞理論進一步發(fā)展。

氣相雙動態(tài)固態(tài)發(fā)酵反應器通過周期性壓力脈動和氣體內部循環(huán)，可有效促進固態(tài)基質散熱，近年來該技術得到較快發(fā)展。壓力脈動頻率是決定散熱速率的一個關鍵參數(shù)，通過建立熱量平衡模型，對脈動頻率進行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)變頻脈動是氣相雙動態(tài)固態(tài)發(fā)酵的最佳操作模式，可有效促進熱量傳遞和提高發(fā)酵產量[78]。

4 未來發(fā)展趨勢展望

工業(yè)生物過程研究的最終目標是要將實驗室形成的優(yōu)化工藝推廣放大到工業(yè)過程中，實現(xiàn)工業(yè)生物過程的高效轉化?；谝陨戏治隹梢钥闯錾镞^程工程的發(fā)展在經歷了初期以化工過程研究中的計量學、反應動力學為基礎的生物過程黑箱動力學模型，到后期的用于工業(yè)生物過程優(yōu)化控制的基于人工神經網絡、遺傳算法、模式識別等，基于單因素或基于統(tǒng)計分析的各種方法的應用，都很難全面地把握過程中不同反應尺度上的相互關系，而基于生物過程多參數(shù)相關分析的過程多尺度理論的提出，使實驗室規(guī)模與工業(yè)規(guī)模過程生理代謝參數(shù)的相關性分析得以實施，從而利用過程參數(shù)相關分析方法實現(xiàn)工業(yè)生物過程的優(yōu)化與放大，并在多個工業(yè)應用案例中取得成功。然而要最終實現(xiàn)理性放大，單純基于專家經驗的過程參數(shù)分析還存在一定的不足，需要深入挖掘過程放大中，反應器內流場的差異導致的細胞生理代謝差異間的機制。

工業(yè)規(guī)模反應器內的流場結構與實驗室規(guī)模反應器相比具有分布不均勻的特點，而細胞在分布不均勻的底物濃度場中所表現(xiàn)出來的生理代謝特性會明顯區(qū)別于均勻濃度場下的結果。因而有必要從流場和細胞生理代謝兩個角度來描述這一過程。因此提出了基于反應器流體動力學和細胞反應動力學整合的理性放大方法[79-81]。具體說來，就是將流體力學模擬與生物過程模型模擬相結合，通過結合黑箱模型、結構化動力學模型，甚至在今后結合小規(guī)模的基因尺度代謝網絡動力學模型，實現(xiàn)包含有菌體自身特性的生物過程模擬。計算反應動力學(Computational reaction dynamics, CRD) 與計算流體力學 (Computational fluid dynamics, CFD)的結合，將成為今后研究生物過程及工業(yè)規(guī)模優(yōu)化的一個重要方向。

對于固態(tài)發(fā)酵過程的發(fā)展來講，廣義上，現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的區(qū)別主要在于發(fā)酵工程是否實現(xiàn)集約化、機械化和自動化。狹義上，研究者認為能否實現(xiàn)純種大規(guī)模集約化生產是區(qū)別現(xiàn)代與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的主要指標[68]。固態(tài)發(fā)酵反應器為微生物的生長及代謝產物的產生提供適宜的環(huán)境條件及空間，固態(tài)發(fā)酵反應器的發(fā)展標志著現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵的進步。作者等基于法向周期作用力刺激原理，提出了新的固態(tài)發(fā)酵反應器設計思路，即以流體靜力學理論為基礎，以法向作用力為動力源，強調生物反應器是一個非線性活細胞代謝與周圍環(huán)境進行質量、熱量、能量、信息交換的生態(tài)系統(tǒng)，是由生命系統(tǒng)和環(huán)境系統(tǒng)組成的特定空間，而不是單一的裝置。基于該原理發(fā)明了氣相雙動態(tài)固態(tài)發(fā)酵新技術，通過發(fā)酵反應器中氣流的周期性脈動和循環(huán)，有效改善了固態(tài)發(fā)酵過程中的熱量傳遞和氧氣傳遞，促進了菌體的生長和代謝，縮短了發(fā)酵周期，目前該技術及裝置已成功放大到100 m3[68]。

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