周李華，葉德萍，王 智，譚和平

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

DNA回收試劑盒技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究

周李華，葉德萍，王 智，譚和平

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

通過(guò)對(duì)DNA回收試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀研究以及國(guó)內(nèi)外典型品牌DNA回收試劑盒的測(cè)試和比較分析，建議DNA回收試劑盒技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，包括柱子最大承載量、可承受最大質(zhì)量、最小洗脫體積、最大容積、典型回收率等技術(shù)參數(shù)。這有助于統(tǒng)一規(guī)范DNA回收試劑盒技術(shù)指標(biāo)，為建立DNA回收試劑盒技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)奠定良好基礎(chǔ)，對(duì)提高DNA回收試劑盒質(zhì)量具有實(shí)際意義。

DNA回收；回收率；質(zhì)量；技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

0 引 言

DNA回收純化是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要一環(huán)[1]，是DNA檢驗(yàn)的關(guān)鍵技術(shù)[2]。其試劑盒主要有離心柱型和磁珠型兩種[3-6]，離心柱型主要是將硅膠膜固定在離心管中，通過(guò)離心力或者負(fù)壓讓含有核酸的溶液通過(guò)硅膠膜，使核酸在特定溶液環(huán)境中吸附在硅膠膜上，經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫等步驟得到純的核酸。目前大多數(shù)回收試劑盒主要是采用該方法來(lái)回收核酸，這種方法操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短。

1 DNA回收試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀

通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)、分析報(bào)告（COA報(bào)告）以及對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)分析，對(duì)PCR純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等參數(shù)和指標(biāo)進(jìn)行了研究（見(jiàn)表1）?？梢?jiàn)，各參數(shù)相差不大，都涵蓋回收率、回收片段范圍等主要參數(shù)。但大部分對(duì)DNA回收試劑盒還沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的統(tǒng)一評(píng)價(jià)方法，無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)指標(biāo)要求尚不明確，各生產(chǎn)商根據(jù)生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和品牌宣傳的需要，在參數(shù)和指標(biāo)上各成系統(tǒng)，如標(biāo)示回收率有60%～95%不等。

表1 國(guó)內(nèi)外DNA回收試劑盒技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)比較表

2 DNA回收試劑盒標(biāo)示參數(shù)堯指標(biāo)的測(cè)試和比較分析

本試驗(yàn)根據(jù)典型品牌DNA回收試劑盒質(zhì)控報(bào)告，從柱子最大承載量、DNA回收產(chǎn)物純度、DNA回收率等關(guān)鍵指標(biāo)對(duì)典型品牌的6種回收試劑盒進(jìn)行了測(cè)試和比較分析。

2.1 試驗(yàn)部分

2.1.1 儀器與試劑

1）儀器

電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene）；恒溫水浴鍋（德國(guó)Julabo）；冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；超純水機(jī)（美國(guó)Millipore）；超凈工作臺(tái)；紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)熱電NanoDrop2000）。

2）主要試劑

DNA回收試劑盒（6個(gè)典型品牌）；DNA Fragment：10～30 000 bp（Fermentas）；λ-Hind III digest（Fermentas）；Lambda DNA （Fermentas）；Hind III（NEB）；T4 DNA Ligase（NEB）。

標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液的配制：將不同的DNA Fragment（10～30000bp）用TE緩沖液配制成500ng/μL的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

2.1.2 方法

1）回收DNA片段

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2）吸附柱的承載量測(cè)定

將500bp DNA Fragment溶液按照表2體系混合后加入吸附柱，測(cè)定其承載量。

表2 吸附柱承載量試驗(yàn)體系表

參照待測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)清洗、洗脫步驟，收集回收液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定回收的DNA溶液在260 nm處的吸收值，得出回收DNA總量，以DNA上樣量為橫坐標(biāo)繪制回收量曲線圖，曲線上限即為吸附柱的承載量。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

3）DNA回收產(chǎn)物的純度測(cè)定

①采用紫外分光光度法。以洗脫液做參比，將試劑盒回收得到的DNA溶液，根據(jù)GB/T 30988——2014《多酚類植物基因組DNA提取純化及測(cè)試方法》中方法測(cè)定樣品溶液吸收值，并判斷其純度。同時(shí)，將回收得到的DNA溶液，在1.0%的瓊脂糖凝膠上樣電泳，電泳結(jié)束后可在凝膠成像系統(tǒng)上觀察回收DNA純度及降解程度。

②酶切回收再連接試驗(yàn)。λ DNA酶切產(chǎn)物制備和連接反應(yīng)參照文獻(xiàn)[7]文獻(xiàn)進(jìn)行。酶切和連接產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠上樣電泳，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法回收DNA。

4）回收率和濃度測(cè)定

將10～30 000 bp不同長(zhǎng)度片段的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)用雙蒸水進(jìn)行空白對(duì)照。電泳完成后在紫外凝膠成像儀上觀察DNA條帶的位置，分別用刀片切下各目的條帶用于膠回收?；厥詹襟E、操作流程和試劑用量參照待測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

符合純度要求的回收產(chǎn)物，采用紫外分光光度計(jì)，依據(jù)GB/T 30988——2014方法測(cè)定和計(jì)算濃度，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。同時(shí)，采用泳帶強(qiáng)度分析法，測(cè)定回收前后DNA溶液在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳譜圖的強(qiáng)度值，根據(jù)強(qiáng)度的比值得出回收率。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 吸附柱的最大承載量比較

圖1為兩個(gè)品牌的DNA凝膠回收試劑盒最大承載量測(cè)試圖，從圖上可知，品牌1回收試劑盒吸附柱最大承載量約為30μg，達(dá)到說(shuō)明書(shū)指標(biāo)40μg的75%。而品牌2吸附柱最大承載量約為10μg，只能達(dá)到說(shuō)明書(shū)指標(biāo)20μg的50%。

圖1 最大承載量比較圖

本試驗(yàn)選取500bp的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)最大承載量進(jìn)行測(cè)試，該片段是各個(gè)試劑盒基本涵蓋的典型回收片段，回收率原則上能達(dá)到說(shuō)明書(shū)標(biāo)示指標(biāo)。結(jié)果顯示，待測(cè)試劑盒回收量與試劑盒的最大承載量相關(guān)性很大，不是上樣量越多，回收量越高。而是在柱子最大承載量范圍內(nèi)，上樣量越多，回收量越高。

表3 各品牌回收試劑盒純度測(cè)定

2.2.2 DNA回收產(chǎn)物純度比較

由表2可知，各品牌的A260/A280，A260/A230， A260/A270的比值比較理想，表明嚴(yán)格按照試劑盒試驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)操作，純度基本合格，部分試劑盒回收產(chǎn)物含有少量雜質(zhì)。從圖2和圖3可看出，回收片段完整性好，能較好的用于后續(xù)連接等操作過(guò)程，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖2 DNA回收片段電泳圖譜

圖3 酶切回收連接試驗(yàn)電泳圖譜

2.2.3 DNA回收率比較

本試驗(yàn)對(duì)不同片段長(zhǎng)度的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收，綜合評(píng)價(jià)試劑盒的回收率。從圖4可知，高回收率集中在100～10 000 bp之間，500～5 000 bp之間為典型片段，低于100bp和高于10000bp回收率迅速下降，試驗(yàn)用試劑盒一般能達(dá)到標(biāo)示回收率的60%，部分試劑盒在典型片段范圍可超過(guò)標(biāo)示指標(biāo)的90%，經(jīng)測(cè)定平均回收率約為40%，達(dá)不到標(biāo)識(shí)指標(biāo)的70%。

圖4 不同試劑盒回收率比較圖

圖5 品牌5單一DNA片段回收電泳圖譜

表4 DNA回收試劑盒技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)建議表

圖6 品牌6混合DNA片段回收電泳圖譜

圖7 品牌1和2單一DNA回收電泳圖譜

圖8 品牌1和2混合DNA回收電泳圖譜

從圖5～圖8的電泳圖譜，借助凝膠軟件分析的譜帶強(qiáng)度值，得出的回收率與紫外分光法檢測(cè)得出的回收率相當(dāng)。

3 DNA回收試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建議

試劑盒法是一種常用的DNA回收方法，也是目前許多實(shí)驗(yàn)室回收DNA的主要方法。因需求量大，試劑盒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，品種多樣，但有大部分試劑盒效果不甚想理。相關(guān)部門并未對(duì)其產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行規(guī)定，所以當(dāng)前試劑盒市場(chǎng)比較混亂，良莠不齊，為了試劑盒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，急需建立試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)的指導(dǎo)性標(biāo)準(zhǔn)。筆者通過(guò)分析測(cè)試建議DNA回收試劑盒的質(zhì)量指標(biāo)指標(biāo)如表4所示。

4 結(jié)束語(yǔ)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌厥盏腄NA可用于載體連接、基因重組、序列分析、探針制備等后續(xù)工作?；厥盏腄NA產(chǎn)物質(zhì)量和回收率，是影響后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)程的關(guān)鍵。在抗體庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中，DNA回收效率的高低對(duì)所構(gòu)建抗體庫(kù)的質(zhì)量有十分重要的意義[8]?；厥盏腄NA片段質(zhì)量達(dá)不到要求，后續(xù)試驗(yàn)就無(wú)法進(jìn)行。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)6個(gè)典型品牌回收試劑盒的回收率和回收產(chǎn)物質(zhì)量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明有大部分試劑盒，回收率和回收效果不甚想理，達(dá)不到產(chǎn)品標(biāo)識(shí)指標(biāo)，這與周君等[1]得出的結(jié)論一致。大部分回收試劑盒達(dá)不到說(shuō)明書(shū)中的技術(shù)指標(biāo)（70%以上），妨礙了后續(xù)操作的進(jìn)行，特別是回收一些大片段（如14×103bp的載體）時(shí)回收率更低。

通過(guò)對(duì)DNA回收試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查研究，對(duì)典型品牌DNA回收試劑盒進(jìn)行測(cè)試和比較分析，建議了柱式DNA回收試劑盒質(zhì)量指標(biāo)，兼顧了試劑盒的回收率、回收純度、回收片段范圍等關(guān)鍵指標(biāo)的普適要求和寡核苷酸等特殊指標(biāo)應(yīng)用適應(yīng)性要求，同時(shí)對(duì)柱子最大承載量、最大容積、最大質(zhì)量和最小洗脫體積等輔助指標(biāo)進(jìn)行了規(guī)定，建議參數(shù)顯著增加，質(zhì)量指標(biāo)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。一定程度上解決了DNA回收試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)據(jù)可依的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，為建立DNA回收試劑盒質(zhì)量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)試劑盒質(zhì)量的提升具有重要意義。

[1]周君，陳正凱，徐劍，等.瓊脂糖凝膠中DNA回收技術(shù)的探討[J].常熟理工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，21（8）：43-47.

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Study on technical standard of DNA extraction Kit

ZHOU Lihua，YE Deping，WANG Zhi，TAN Heping
（National Institute of Measurement and Testing Technology，Chengdu 610021，China）

Through the present situation study of the quality standard of DNA Extraction Kits，and Analysis of DNA Extraction Kits of domestic and foreign factories.DNA Extraction Kit technicalstandard were advised.This helps to unified standard ofDNA Extraction Kit technology index and imported DNA Extraction Kits quality.It is also lays a foundation for the DNA Extraction Kit quality measurement standard.

DNA extraction；DNA recovery；quality；technical standard

A

：1674-5124（2015）07-0051-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.07.012

2015-01-09；

：2015-02-24

周李華（1978-），女，湖南茶陵縣人，碩士，主要從事測(cè)試技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究。